Characterisation of a family of Pry-proteins in Candida albicans

Die Mitglieder der Superfamilie der CAP-Proteine sind ubiquitär verbreitet und zeichnen sich durch eine konservierte zentrale Domäne aus, die ihnen eine außerordentlich stabile drei-dimensionale Struktur verleiht und die den strukturellen Anforderungen extrazellulär wirkender Proteine entspricht. Der Grad der Sequenz- und Strukturhomologien dieser Proteine deutet auf einen ähnlichen Wirkmechanismus hin, die molekulare Funktion der CAP-Proteine ist bis heute jedoch unklar. In dieser Arbeit wurde eine bisher nicht beschriebene Familie von CAP-Proteinen in C. albicans identifiziert und deren Mitglieder funktionell charakterisiert. In Analogie zu S. cerevisiae sollen diese als Pry-Proteine bezeichnet werden (pathogenesis-related in yeast). Die Pry-Proteinfamilie in C. albicans umfasst 5 Mitglieder, die im Zusammenhang mit der Morphogenese von C. albicans (Hefe – Hyphe, white – opaque) differentiell reguliert sind. Alle 5 Familienmitglieder weisen spezifische strukturelle Merkmale sekretierter Proteine auf. Transkriptionelle Studien zeigen, dass die beiden Pry-Proteine Rbe1p und Rbt4p von den zentralen Regulatoren der Morphogenese in C. albicans, Efg1p und Tup1p, gegensätzlich reguliert werden. Dabei wird Rbe1p v.a. in Blastosporen und opaque-Zellen, Rbt4p degegen in Hyphen exprimiert. Die Promotorsequenz von RBE1 umfasst 1039 bp und enthält eine aktivierende und eine reprimierende Domäne für die Transkription. Obwohl diese mehrere mögliche Bindestellen für Efg1p aufweisen, bindet heterolog exprimiertes Efg1p offensichtlich nicht an den RBE1-Promotor, so dass die Regulation von RBE1 voraussichtlich indirekt durch Efg1p erfolgt. Massenspektrometrische Analysen des C. albicans-Sekretoms weisen Rbe1p und Rbt4p als sekretierte Proteine in C. albicans aus. Dabei ist Rbe1p ein spezifisch von Blastosporen sekretiertes Protein, während Rbt4p ein Bestandteil des Sekretoms von Blastosporen und Hyphen ist. Heterolog exprimiertes Rbe1p und Rbt4p zeigen keine für die CAP-Proteine postulierte Funktion als Protease. Deletionsstudien für RBE1 und RBT4 in SC5314 zeigen keinen Phänotyp auf gängigen Labormedien, sowie keine Beteiligung an der Adhäsion und Invasion humanen Epithelgewebes. In Kombination führt die Deletion beider Gene allerdings zu einer starken Attenuation der Virulenz in einem intravenösen Mausmodell für systemische Kandidosen. Diese tritt bei einer Deletion nur eines der beiden PRY-Gene nur schwach zutage, da in diesen Stämmen das jeweils andere PRY-Gen kompensatorisch induziert wird. Dieser synergistische Virulenzphänotyp spricht für eine ähnliche Funktion der beiden Proteine sowie für eine Regulation durch ähnliche Signalwege.The members of the CAP superfamily of proteins are disseminated in a widespread range of organisms of all kingdoms and are characterized by a conserved central domain that accounts for an extraordinary stable three-dimensional structure, meeting the structural requirements for proteins functioning in the extracellular environment. The PR-1 (pathogenesis-related) subfamily of these proteins has already been described in plants as being expressed in response to challenge with pathogens. The degree of sequence and structural homologies between these proteins points to a similar mode of action, yet the molecular function of the CAP proteins is not known. Based on database searches, we identified a similar family of proteins in C. albicans comprising five members with homology to PR-1 proteins in plants. In addition to RBE1 and RBT4, we could assign three yet not further characterized open reading frames, ORF19.6200, ORF19.2787 as well as ORF19.2336, to this family of proteins. In analogy to S. cerevisiae, the members of this family are termed Pry proteins (pathogenesis-related in yeast). Structurally, all of these proteins dispose of characteristics of secreted proteins. RBE1 is expressed in blastospores and opaque cells and is downregulated in hyphae. On the contrary, RBT4 is upregulated in hyphae compared to blastospores and downregulated in opaque cells. Transcript levels for the other family members are generally low under these conditions. Transcription of RBE1 and RBT4 is repressed by EFG1 and TUP1, respectively, thus accomplishing their morphogenesis-related expression. Mass spectrometric analyses of the C. albicans secretome show that both Rbe1p and Rbt4p are secretory proteins in C. albicans. Rbe1p is secreted specifically by yeast cells, whereas Rbt4p is secreted by both yeast and hyphal cells. Single deletion mutants of RBE1 and RBT4 as well as the corresponding Δrbe1/Δrbt4 double mutant in the clinical isolate SC5314 do not show any obvious phenotype under common morphogenesis-inducing conditions. Moreover, no significant differences were found in in vitro adhesion and invasion assays employing different cellular epithelia in comparison to the wildtype. However, applying a mouse model for disseminated candidiasis, the Δrbe1 and Δrbt4 single deletion strains showed a moderate but significant virulence phenotype. A synergistic effect was observed in the Δrbe1/Δrbt4 double mutant for which virulence was strongly attenuated. Strikingly, RBE1 transcript levels are upregulated in the Δrbt4 mutant strain and vice versa, indicating that both proteins share similar molecular functions or are implicated in similar physiological processes critical for virulence in vivo

Recognition of Aspergillus fumigatus Hyphae by Human Plasmacytoid Dendritic Cells Is Mediated by Dectin-2 and Results in Formation of Extracellular Traps

Plasmacytoid dendritic cells (pDCs) were initially considered as critical for innate immunity to viruses. However, our group has shown that pDCs bind to and inhibit the growth of Aspergillus fumigatus hyphae and that depletion of pDCs renders mice hypersusceptible to experimental aspergillosis. In this study, we examined pDC receptors contributing to hyphal recognition and downstream events in pDCs stimulated by A. fumigatus hyphae. Our data show that Dectin-2, but not Dectin-1, participates in A. fumigatus hyphal recognition, TNF-α and IFN-α release, and antifungal activity. Moreover, Dectin-2 acts in cooperation with the FcRγ chain to trigger signaling responses. In addition, using confocal and electron microscopy we demonstrated that the interaction between pDCs and A. fumigatus induced the formation of pDC extracellular traps (pETs) containing DNA and citrullinated histone H3. These structures closely resembled those of neutrophil extracellular traps (NETs). The microarray analysis of the pDC transcriptome upon A. fumigatus infection also demonstrated up-regulated expression of genes associated with apoptosis as well as type I interferon-induced genes. Thus, human pDCs directly recognize A. fumigatus hyphae via Dectin-2; this interaction results in cytokine release and antifungal activity. Moreover, hyphal stimulation of pDCs triggers a distinct pattern of pDC gene expression and leads to pET formation

Assessment of Neutrophil Chemotaxis Upon G-CSF Treatment of Healthy Stem Cell Donors and in Allogeneic Transplant Recipients

Neutrophils are crucial for the human innate immunity and constitute the majority of leukocytes in circulation. Thus, blood neutrophil counts serve as a measure for the immune system's functionality. Hematological patients often have low neutrophil counts due to disease or chemotherapy. To increase neutrophil counts and thereby preventing infections in high-risk patients, recombinant G-CSF is widely used as adjunct therapy to stimulate the maturation of neutrophils. In addition, G-CSF is utilized to recruit stem cells (SCs) into the peripheral blood of SC donors. Still, the actual functionality of neutrophils resulting from G-CSF treatment remains insufficiently understood. We tested the ex vivo functionality of neutrophils isolated from blood of G-CSF-treated healthy SC donors. We quantified chemotaxis, oxidative burst, and phagocytosis before and after treatment and detected significantly reduced chemotactic activity upon G-CSF treatment. Similarly, in vitro treatment of previously untreated neutrophils with G-CSF led to reduced chemotactic activity. In addition, we revealed that this effect persists in the allogeneic SC recipients up to 4 weeks after neutrophil engraftment. Our data indicates that neutrophil quantity, as a sole measure of immunocompetence in high-risk patients should be considered cautiously as neutrophil functionality might be affected by the primary treatment

Teilhabe und Teilhabeforschung - Grundriss und Positionierung

Teilhabeforschung hat den Anspruch, die Forschung zu und mit benachteiligten Personenkreisen, insbesondere Menschen mit Beeinträchtigungen, neu auszurichten. Im Institut für Teilhabeforschung der Katholischen Hochschule Nordrhein-Westfalen (katho NRW) setzen sich Vertreter_innen unterschiedlicher Disziplinen teilhabeorientiert mit den Lebenssituationen von Menschen mit Behinderung und/oder Menschen im Alter auseinander. Der bereits seit 2010 gegründete Forschungsschwerpunkt bildete die Basis für das 2016 gegründete Institut für Teilhabeforschung. Das Institut vereinigt zwei Forschungsfelder: die Forschung zur Teilhabe von Menschen mit Behinderung, die aufgrund der heilpädagogischen Studiengänge einen Schwerpunkt in der Abteilung Münster hat, und die Forschung zur Teilhabe im Alter, zu der sich Wissenschaftler_innen aus den vier Abteilungen Aachen, Paderborn, Köln und Münster zusammengefunden haben. Die Zusammenführung und Zusammenarbeit dieser Forschungsfelder liegen aus folgenden Gründen nahe: - Die Zielgruppen überschneiden sich (am häufigsten werden Beeinträchtigungen im Alter erworben; Menschen mit lebensbegleitender Behinderung altern). - Konzepte der selbstbestimmten Teilhabe haben als Leitidee für die Unterstützung der Lebensführung in beiden Feldern an Bedeutung gewonnen. - Beide Felder können sich in Bezug auf Forschungsthemen, Konzepte und Theorien sowie Forschungsmethoden gegenseitig befruchten. - In der Praxis kooperieren Unterstützungsstrukturen in beiden Feldern zunehmend in denselben Sozialräumen. Ausgehend von den vielfältigen Forschungsaktivitäten im Institut entstand ein Diskurs darüber, was Teilhabeorientierung in der Forschung ausmacht. Die vorliegende Schrift ist das Ergebnis dieses Diskussionsprozesses. Ihr Ziel ist es, - zu spezifizieren, wie das Institut Teilhabe versteht; - herauszuarbeiten, was unseres Erachtens Teilhabeforschung auszeichnet; - den Ansatz der Teilhabeforschung für die Forschungsfelder Behinderung und Alter fruchtbar zu machen. In dieser Schrift wird zum einen das Verständnis von Teilhabeforschung aus der Perspektive des Instituts dargelegt. Die verschiedenen Blickwinkel auf Teilhabe, die mit einer interdisziplinären Arbeitsweise einhergehen, werden zusammengeführt, verortet und dadurch geschärft. Zum anderen möchte sich das Institut im Diskurs zur Teilhabeforschung richtunggebend positionieren. Teilhabeforschung zu entwickeln ist ein Prozess, den das Institut sowohl inhaltlich als auch methodisch weiter mitgestalten möchte. Für die Personenkreise, die die Forschenden in den Fokus nehmen, sollen Veränderungen der gesellschaftlichen Wirklichkeit durch Grundlagen, wie anwendungsbezogene Forschung angebahnt werden. Die Lebenswirklichkeiten von Menschen mit Behinderung und Menschen im Alter nebst ihrer Zugehörigen sollen verstärkt in den Blick genommen werden. Zudem sollen diese Personenkreise stärker am gesamten Forschungsprozess beteiligt werden. Die vorliegende Schrift behandelt - die derzeitige gesellschaftliche Einbettung des Teilhabediskurses, - die disziplinären Auffassungen und Zugänge zum Teilhabebegriff, - das Verständnis von Teilhabe des Instituts für Teilhabeforschung, - Ziele, Fragen und Aufgaben der Teilhabeforschung, - Merkmale der Forschungsmethodik und - die Institutionalisierung des Instituts für Teilhabeforschung

Type I Interferon-induced genes.

<p>*Genes previously described as regulated in viral infection.</p><p>^<i>#</i> Significant (<i>P</i><0.05) changes are shown in bold.</p><p>As in <a href="http://www.plospathogens.org/article/info:doi/10.1371/journal.ppat.1004643#ppat.1004643.t001" target="_blank">Table 1</a> except type I IFN-induced genes are shown.</p><p>Type I Interferon-induced genes.</p

Genes encoding type I interferons.

<p>* Significant (<i>P</i><0.05) changes are shown in bold.</p><p>As in <a href="http://www.plospathogens.org/article/info:doi/10.1371/journal.ppat.1004643#ppat.1004643.t001" target="_blank">Table 1</a> except genes encoding type I IFNs are shown.</p><p>Genes encoding type I interferons.</p

<i>A</i>. <i>fumigatus</i> hyphae are recognized by the mannose receptor, Dectin-2, on pDCs.

<p>Human pDCs were purified from PBMCs fractions using CD304-coated magnetic beads. (A) pDCs were treated with no inhibitors, dextran (1 mg/mL), mannan (1 mg/mL), laminarin (0.5 mg/mL) or mannan and laminarin for 30 minutes. The pDCs (5×10⁴) were then incubated for 2 hr with <i>A. fumigatus</i> hyphae (5×10⁴). The cell association was quantified by counting number of pDCs associated (touching or spreading over) with hyphae in 10 different fields. The percent cell association was calculated by dividing the number of pDC associated with hyphae by the total number of pDC counted and then multiplying by 100. (B) Same as in A except pDCs were treated with anti-Dectin-1 (100 μg/mL) and anti-Dectin-2 (100 μg/mL) antibodies for 30 minutes prior to incubation with hyphae. Data represent means ± SE of % cell association from three donors. *<i>P</i><0.05. (C) Representative photomicrographs of pDCs incubated with <i>A</i>. <i>fumigatus</i> hyphae under the conditions described in panel B.</p

The two extracellular nucleases of <i>V. cholerae</i> are able to degrade NETs.

<p><b>A</b>. DNA release of neutrophils was stimulated with PMA (indicated by the arrow “PMA”) and followed by incubation with the respective <i>V. cholerae</i> strain (MOI 40, time point of addition is indicated by the arrow “Vch”). Staining of DNA by the cell impermeant fluorescent DNA dye Sytox green was measured in 10 min intervals. Values are presented as percentage of DNA fluorescence compared with the Triton ×100 lysis control (100%) indicating NET formation, respectively. Shown are medians of at least six measurements out of three independent donors. <b>B</b>. Human neutrophils were stimulated with <i>V. cholerae</i> WT or Δ<i>dns</i>Δ<i>xds</i> mutant (MOI 4) in presence of the cell impermeant fluorescent DNA dye Sytox green and monitored by live cell imaging. Shown are images of the indicated time points. The complete movies are available as <a href="http://www.plospathogens.org/article/info:doi/10.1371/journal.ppat.1003614#ppat.1003614.s005" target="_blank">movie S1</a> (<i>V. cholerae</i> WT) and <a href="http://www.plospathogens.org/article/info:doi/10.1371/journal.ppat.1003614#ppat.1003614.s006" target="_blank">S2</a> (Δ<i>dns</i>Δ<i>xds</i> mutant) in the supporting information.</p