Oligonucleotides Modified With Transplatin Derivatives: Fast and Efficient Metalloribozymes

When an oligonucleotide containing a 1,3-(G,G)-transplatin cross-link at a GNG site (N represents a C, T, A or U residue) is paired with its complementary strand, the intrastrand adduct rearranges into an interstrand cross-link, resulting in the covalent attachment of both strands. Here, we have studied the influence of the inert ligands of the platinum(II) complex and of the nucleotide residues in the vicinity of the adduct on the rearrangement reaction. Dramatic effects on the linkage isomerization rate could be 37℃. The results are analyzed in relation with the mechanism of rearrangement of the 1,3-intrastrand adducts into interstrand cross-links. The relevance of platinated oligonucleotides as potent and specific drugs is discussed

Régulation des gènes par un moteur moléculaire unique aux bactéries

National audienceTous les êtres vivants possèdent des mécanismes spécifiques d’adaptation à leur écosystème et, éventuellement, aux variations environnementales. Ce caractère adaptatif est très marqué chez de nombreuses bactéries, capables de vivre ou survivre dans des conditions variables et difficiles, grâce notamment à des mécanismes de régulation post-transcriptionnelle de l’expression de leurs gènes. Je décrirai l’un de ces mécanismes fondamentaux, la terminaison de la transcription Rho-dépendante, qui est unique aux bactéries, essentiel chez de nombreuses espèces et repose sur l’activité d’un moteur moléculaire à activité ARN hélicase, Rho. Je montrerai notamment comment l’exploitation de cette activité ARN hélicase dans une nouvelle stratégie de criblage combinatoire, Helicase-SELEX, nous a permis de cartographier précisément les nombreux sites d’action de Rho à l’échelle d’un génome entier (Escherichia coli). Je discuterai nos résultats dans un contexte de diversité bactérienne, d’adaptation conditionnelle et d’exploitation de l’activité hélicase à des fins biotechnologique

Methods in Molecular Biology - RNA remodeling proteins

International audienceThis volume provides the most current methods to study RNA remodeling proteins. Chapters detail methods, ranging from basic to complex, procedures to identify RNA remodeling proteins and their cofactors, physiological RNA targets and biological functions, and complex molecular mechanisms of action using purified components. Written in the highly successful Methods in Molecular Biology series format, chapters include introductions to their respective topics, application details for both the expert and non-expert reader, and tips on troubleshooting and avoiding known pitfalls.Authoritative and cutting-edge, RNA Remodeling Proteins: Methods and Protocols, Second Edition aims to ensure successful results in the further study of this vital field

Mechanisms and regulation of an essential RNA helicase in E. coli (the bacterial transcription termination factor Rho)

Chez E. coli, Rho est un facteur essentiel qui contrôle l expression de multiples unités transcriptionnelles via le phénomène de terminaison de la transcription. Rho est un moteur moléculaire ATP-dépendant ayant une activité ARN hélicase caractéristique de sa capacité à dissocier des obstacles (comme l ARN polymérase) lors de sa translocation le long de sa piste ARN. Il existe différentes structures de Rho en interaction avec l ARN qui suggèrent des mécanismes de translocation contradictoires. Afin de mieux comprendre ces mécanismes, nous avons utilisé deux approches complémentaires pour identifier les fonctionnalités moléculaires importantes au sein de l ARN et de Rho : l approche NAIM (Nucleotide Analog Interference Mapping) développée au laboratoire et la mutagenèse dirigée. Nos résultats excluent une organisation de l anneau hexamérique en trimère de dimère (ainsi que les mécanismes de translocation qui en découlent) mais sont compatibles avec différents aspects rencontrés dans une structure en anneau asymétrique plus récente. Toutefois, nos résultats ne supportent pas le mécanisme d escorte nucléotide par nucléotide qui découle de cette structure asymétrique. Ainsi, nous montrons que Rho contacte la chaîne ARN de façon hétérogène et ne nécessite un groupement 2 -OH que tous les sept nucléotides en moyenne. Par ailleurs, nous avons exploré l interactome d E. coli dans le but d identifier d éventuels régulateurs de la fonction de Rho. Nous montrons que la protéine hexamèrique Hfq présente une similitude topologique avec les protéines endogènes NusG et YaeO et que, comme elles, Hfq s associe à Rho pour en réguler la fonction. L interaction Hfq:Rho inhibe les activités enzymatiques de Rho. Ces résultats révèlent un nouveau mécanisme d anti-terminaison de la transcription avec diverses implications possibles dans le métabolisme bactérien et/ou la virulence de germes pathogènes.In E. coli, Rho is an essential factor that controls the expression of multiple transcriptional units via the phenomenon of transcription termination. Rho is an ATP-dependent molecular motor displaying RNA helicase activity, a feature typical of Rho s ability to dissociate obstacles (such as RNA polymerase) during translocation along its RNA track. Different structures of the Rho-RNA complex have been published and suggest contradictory mechanisms of translocation. In order to understand these mechanisms, we have used two complementary approaches to identify functionality molecular comports in RNA and Rho : the NAIM (Nucleotide Analog Interference Mapping) approach developed in the laboratory and site-directed mutagenesis. Our results exclude that Rho forms a functional "trimer of dimer" ring (which rules out related translocation mechanisms) but are compatible with various aspects encountered in a recent asymmetric ring structure. However, our results do not support the "nucleotide by nucleotide" escort mechanism inferred from this asymmetric structure. Indeed, we show that Rho forms heterogonous contacts with the RNA chain and only requires a 2'-OH every seven nucleotides on average. Furthermore, we explored the interactome of E. coli in order to identify potential regulators of Rho function. We show that the hexameric protein Hfq displays topological similarity with the endogenous proteins NusG and YaeO and, that, like them, Hfq associates with Rho to regulate Rho function. The Hfq:Rho interaction inhibits the enzymatic activities of Rho. These results reveal a novel mechanism of transcription anti-termination with potentially important implications in bacterial metabolism and/or virulence of pathogens.ORLEANS-SCD-Bib. electronique (452349901) / SudocSudocFranceF

Etude in vitro de l'activité ARN-ADN hélicase du facteur de terminaison transcriptionnelle Rho d'Escherichia coli

Chez E.coli, la protéine Rho gouverne près de la moitié des évènements de terminaison transcriptionnelle. Rho forme un anneau hexamérique encerclant le transcrit naissant au niveau d'une séquence d'entrée Rut, à partir de laquelle Rho se déplace le long de l'ARN. Il a été proposé que l'efficacité de terminaison repose sur une compétition cinétique entre deux machines moléculaires (Rho et l'ARN polymérase), de telle sorte que si Rho rattrape le complexe ternaire de transcription, il induit sa dissociation suivant un mécanisme probablement apparenté à son activité ARN-ADN hélicase. Pour valider ce modèle, nous avons étudié systématiquement cette activité hélicase avec des substrats ARN-ADN contenant une courte séquence d'entrée synthétique (aRut) découverte au laboratoire. Par le biais d'expériences hélicases réalisées en condition de cycle unique et de cycles multiples, nous avons montré que l'activité hélicase de Rho résulte d'un mouvement unidirectionnel 5'3' depuis la séquence aRut. La formation d'un complexe productif, Rho-substrat, au niveau du site d'entrée est un événement complexe très sensible aux conditions expérimentales et qui contrôle cinétiquement la réaction hélicase dans toutes les conditions testées. En moyenne, Rho se dissocie de son substrat après avoir déroulé 60-80 pb d'un hybride ARN-ADN. Cette processivité modérée suggère le passage vers des formes ouvertes transitoires de l'anneau hexamérique lors du déroulement de régions en double hélices. Rho déplace des obstacles suivant un mécanisme présentant de fortes analogies avec celui proposé pour les ADN hélicases réplicatives. L'ensemble de ces résultats ont été intégré dans un modèle de compétition cinétique révisé.ORLEANS-BU Sciences (452342104) / SudocSudocFranceF

Procédé de pontage sélectif et irréversible d'oligonucléotides platinés sur de l'ARN et ses applications

L'invention concerne un procédé de fixation spécifique et irréversible d'un oligonucléotide sur un ARN, caractérisé en ce que l'on met en contact un oligonucléotide platiné contenant un adduit intrabrin du transplatine ou de ses analogues, avec un ARN comprenant ou constitué par une séquence complémentaire spécifique dudit oligonucléotide, dans des conditions permettant la formation d'hybrides, de façon à obtenir rapidement un hybride ponté par le biais d'un adduit interbrin. L'invention concerne aussi l'application du procédé à la purification, la détection et au blocage d'ARN et des oligonucléotides antisens

Interstrand Crosslinking Reaction in Transplatin-Modified Oligo-2‵-O-Methyl Ribonucleotide-RNA Hybrids

International audienceIn the context of developing an approach to irreversibly and specifically link oligonucleotides to RNA, the purpose of this work was to determine the factors interfering with the rate of the rearrangement of the transplatin 1,3-intrastrand crosslinks into interstrand crosslinks, rearrangement triggered by the formation of a double helix between platinated oligo-2'-O-methyl-ribonucleotides and their complementary strands. The rate of the rearrangement has been studied as a function of the length of the hybrids, the location of the intrastrand crosslinks, the nature of the oligonucleotide backbone, and the nature of the doublet replacing the triplet complementary to the intrastrand crosslinks. The thermal stability of the platinated hybrids has been determined in various salt conditions. The results are discussed in relation to the mechanism of the rearrangement. It is shown that the cellular proteins present weaker nonspecific interactions with single-stranded platinated oligo-2'-O-methyl-nucleotides than with the isosequential oligodeoxyribonucleotides

Evidences for a catalytic activity of the DNA double helix in the reaction between DNA, platinum(II), and intercalators.

International audienc