Structure-function mechanisms in the domain l voltage- sensor domain of the voltage-gated sodium channel Nav1.5

Voltage-gated sodium (Nav) channels underlie the upstroke of the action potential, the fundamental signalling unit common to all excitable tissues. Because of the widespread role they play in neuronal communication, it is pertinent to understand how they function at the molecular level. A large diversity exists within the Nav channel family, given that there are nine genetically-encoded isoforms, each having its own pattern of alternative splicing. Despite this enormous heterogeneity, one region of the Nav channel is spliced consistently across most isoforms – the S3-S4 extracellular linker in domain I. Even though this splicing event occurs in a part of the channel thought to be critical for pore opening, its specific structure-function relationships are still unknown. Here, we used Nav1.5 to probe this phenomenon in more detail. In Nav1.5, alternative splicing of the domain I S3-S4 linker alters the profile of channel activation, despite that changes to channel inactivation have been reported for other isoforms. This thesis elaborates on two facets of this topic. In the first chapter, we attempt to characterize the molecular mechanism by which splicing in domain I brings about the altered activation phenotype in Nav1.5. By engineering key amino acids from one splice-variant into the other and vice versa, we identify two important amino acid switches – aspartate-lysine at position 211 and threonine-serine at position 207 – that are responsible for the difference in gating. Combining electrophysiology with molecular dynamics simulations, we speculate that these exchanges exert their effect by altering the interactions between gating charges and counter-charges within the voltage-sensor domain. Moreover, introducing the key residue exchanges of Nav1.5 into Nav1.4, a related channel without splicing in domain I, led to similar shifts in activation, suggesting that this mechanism might be conserved within part of the Nav channel family. In the second chapter, we attempt to uncover the reason for which splicing became targeted to domain I as opposed to other domains. By neutralizing gating charges in domain I to disrupt its normal function, we conclude that the domain I voltage-sensor domain is the major determinant of the voltage-dependence of channel activation. These results also raised important discrepancies with what is known about how the four Nav channel domains contribute asymmetrically. Contradictory to previous reports, we found domains I and IV to play an important role in setting channel activation in Nav1.5, whereas every domain contributed significantly to channel inactivation. Ultimately, this study illustrates both the mechanism by which (Chapter 1) and the context in which (Chapter 2) alternative splicing in domain I modulates Nav1.5. This is important to understand, because of the potential role that this splicing could play in fine-tuning cell excitability.Les canaux sodium dépendants du voltage (Nav) contribuent à la montée du potentiel d'action, l'unité fondamentale de la signalisation de tous les tissus excitables. Compte tenu de leur rôle étendu dans la signalisation neuronale, il est important de comprendre comment ces derniers fonctionnent au niveau moléculaire. Une énorme diversité existe dans la famille des canaux Nav, étant donné qu'il y a neuf isoformes génétiquement codées, chacune ayant une tendance propre pour l'épissage alternatif. Malgré cette énorme hétérogénéité, une région du canal Nav subit systématiquement l'épissage alternatif dans la plupart des isoformes – le lien extracellulaire entre les segments S3 et S4 du 1er domaine. Quoique cet événement d'épissage alternatif se produit dans une partie du canal qui joue un rôle crucial à l'ouverture du pore, ses rapports structure-fonction précis demeurent inconnus. Nous utilisions Nav1.5 pour étudier ce phénomène plus en détail. Quant à Nav1.5, l'épissage alternatif du lien S3-S4 du 1er domaine modifie le profil d'activation du canal, bien que d'autres effets aient été rapportés pour d'autres isoformes. Dorénavant, cette thèse élabore sur deux facettes de ce sujet. Dans le premier chapitre, nous tentons de caractériser le mécanisme moléculaire par lequel l'épissage alternatif du 1er domaine influence l'activation de Nav1.5. Par l'introduction d'un acide aminé clé d'un variant d'épissage dans un l'autre, et vice versa, nous identifions que deux échanges d'acide aminé – aspartate-lysine à la position 211 et thréonine-sérine à la position 207 – sont responsables pour la différence de déclenchement du canal. Par l'électrophysiologie et les simulations de la dynamique moléculaire, nous spéculons que ces échanges transforment les interactions entre les charges de déclenchement et les contre-charges du domaine sensible à la tension. De plus, l'introduction des résidus clés de Nav1.5 dans Nav1.4, un canal similaire qui manque l'épissage alternatif au 1er domaine, a induit des changements du profil d'activation comparables, suggérant que ce mécanisme pourrait être conservé à travers plusieurs membres de la famille des canaux Nav. Dans le deuxième chapitre, nous essayons de dévoiler la raison pour laquelle le 1er domaine, et non les autres domaines, est devenu cible de l'épissage alternatif. Par la neutralisation des charges de déclenchement du 1er domaine dans le but de perturber sa fonction normale, nous concluons que le domaine sensible à la tension du 1er domaine détermine la dépendance à la tension de l'activation du canal. Ces résultats ont également souligné des incohérences quant à notre compréhension de l'asymétrie des rôles des quatre domaines du canal Nav. En contradiction des rapports précédents, nous avons trouvé que les 1er et 4e domaines servent un rôle majeur dans l'activation du Nav1.5, tandis que tous les quatre domaines contribuent d'une manière significative dans le processus d'inactivation. En somme, cette étude illustre le mécanisme par lequel (Chapitre 1) et le contexte dans lequel (Chapitre 2) l'épissage alternatif du 1er domaine module le Nav1.5. Il est important de comprendre ces derniers, considérant le rôle potentiel que cette modification post-traductionnelle peut servir au réglage de l'excitabilité cellulaire

CryoEM and AI reveal a structure of SARS-CoV-2 Nsp2, a multifunctional protein involved in key host processes.

The SARS-CoV-2 protein Nsp2 has been implicated in a wide range of viral processes, but its exact functions, and the structural basis of those functions, remain unknown. Here, we report an atomic model for full-length Nsp2 obtained by combining cryo-electron microscopy with deep learning-based structure prediction from AlphaFold2. The resulting structure reveals a highly-conserved zinc ion-binding site, suggesting a role for Nsp2 in RNA binding. Mapping emerging mutations from variants of SARS-CoV-2 on the resulting structure shows potential host-Nsp2 interaction regions. Using structural analysis together with affinity tagged purification mass spectrometry experiments, we identify Nsp2 mutants that are unable to interact with the actin-nucleation-promoting WASH protein complex or with GIGYF2, an inhibitor of translation initiation and modulator of ribosome-associated quality control. Our work suggests a potential role of Nsp2 in linking viral transcription within the viral replication-transcription complexes (RTC) to the translation initiation of the viral message. Collectively, the structure reported here, combined with mutant interaction mapping, provides a foundation for functional studies of this evolutionary conserved coronavirus protein and may assist future drug design