Proteínas superficiales de bacterias lácticas con potencialidad biotecnológica: estudios estructurales y funcionales de las proteínas de capa S de Lactobacillus kefiri

La capa S es una estructura de envoltura glico-proteica constituida por subunidades que se auto-ensamblan para formar una matriz bidimensional que cubre completamente la superficie de diferentes especies de bacterias y Arqueas. Debido a su capacidad de formar productos auto-ensamblados en solución, son herramientas atractivas para ser utilizadas como carriers de antígenos o como adyuvantes. Teniendo en cuenta las características funcionales y estructurales extraordinarias que poseen las proteínas de capa S, el objetivo general de este trabajo de tesis fue realizar una caracterización estructural y funcional de las proteínas de capa S de diferentes cepas de Lactobacillus kefiri con el objetivo de desarrollar nuevas herramientas biotecnológicas. En cuanto a la caracterización de la estructura primaria, utilizando técnicas proteómicas y genómicas fuimos capaces de determinar las secuencias de aminoácidos de las proteínas de capa S en dieciséis cepas de L. kefiri, y las secuencias de nucleótidos de los genes que codifican para estas proteínas. Teniendo en cuenta la naturaleza glicoproteica de las proteínas de capa S de L. kefiri, seleccionamos 4 proteínas de capa S provenientes de diferentes cepas de L. kefiri y analizamos la estructura de glicanos unidos a estas proteínas. En las cepas L. kefiri CIDCA 8321 y CIDCA 8348, se encontraron O-glicanos en el mismo motivo de glicosilación descripto para L. buchneri, sustituido por hasta 22 unidades de glucosa. La cepa L. kefiri CIDCA 83111 presenta el mismo glicopéptido, pero sustituido en 4 residuos de serina con un promedio de ocho unidades de glucosa, decoradas con ácido galacturónico. Además, la SLP-83111 cuenta con otro péptido O-glicosilado, con una estructura Glc5-8GalA2, y dos péptidos N-sustituidos con estructuras cortas: GlcNAc4Man3dHex y GlcNAc2dHex. La cepa L. kefiri JCM 5818 cuenta con un O-glicano en la misma posición mencionada para las otras tres cepas, sustituido en promedio con ocho unidades de glucosa, y un N-glicano de estructura compleja con ácido siálico en su estructura. Por último, analizamos las propiedades inmunoestimulatorias de las glicoproteínas de capa S de L. kefiri (SLPs) y el rol funcional que tienen los glicanos sobre estas propiedades. Utilizando líneas celulares de macrófagos demostramos que las proteínas de capa S de las cepas L. kefiri CIDCA 8321, L. kefiri CIDCA 8348, L. kefiri CIDCA 83111 y L. kefiri JCM 5818, si bien no son capaces de inducir una activación de los macrófagos, potencian la respuesta a un agonista TLR, en un proceso dependiente de la presencia de Ca+2 y de la actividad biológica de los glicanos presentes en las glicoproteínas de capa S. Utilizando BMDCs derivadas de ratones deficientes de CLRs específicos, pudimos identificar que la SLP-8321 y SLP-8348 son reconocidas y señalizan a través de Mincle, mientras que la SLP-5818 lo hace a través de SignR3. Esta interacción entre las SLPs y BMDCs induce una activación celular que resulta en un aumento en la capacidad estimulatoria de células T en ensayos de proliferación antígeno-específico. Finalmente, demostramos que la SLP-8348 posee capacidad adyuvante utilizando OVA como antígeno modelo, y que este efecto depende de la actividad biológica de los glicanos presentes en esta glicoproteína de capa S.Facultad de Ciencias Exacta

S-Layer glycoprotein from Lactobacillus kefiri exerts its immunostimulatory activity through glycan recognition by Mincle

The development of new subunit vaccines has promoted the rational design of adjuvants able to induce a strong T-cell activation by targeting specific immune receptors. The S-layer is a (glyco)-proteinaceous envelope constituted by subunits that self-assemble to form a two-dimensional lattice that covers the surface of different species of Bacteria and Archaea. Due to their ability to self-assemble in solution, they are attractive tools to be used as antigen/hapten carriers or adjuvants. Recently, we have demonstrated that S-layer glycoprotein from Lactobacillus kefiri CIDCA 8348 (SLP-8348) enhanced the LPS-induced response on macrophages in a Ca2+-dependent manner, but the receptors involved in these immunomodulatory properties remain unknown. Therefore, we aim to determine the C-type lectin receptors (CLRs) recognizing this bacterial surface glycoprotein as well as to investigate the role of glycans in both the immunogenicity and adjuvant capacity of SLP-8348. Here, using a mild periodate oxidation protocol, we showed that loss of SLP-8348 glycan integrity impairs the cell-mediated immune response against the protein. Moreover, our data indicate that the adjuvant capacity of SLP-8348 is also dependent of the biological activity of the SLP-8348 glycans. In order to evaluate the CLRs involved in the interaction with SLP-8348 an ELISA-based method using CLR–hFc fusion proteins showed that SLP-8348 interacts with different CLRs such as Mincle, SingR3, and hDC-SIGN. Using BMDCs derived from CLR-deficient mice, we show that SLP-8348 uptake is dependent of Mincle. Furthermore, we demonstrate that the SLP-8348-induced activation of BMDCs as well as its adjuvant capacity relies on the presence of Mincle and its signaling adaptor CARD9 on BMDCs, since SLP-8348-activated BMDCs from Mincle−/− or CARD9−/− mice were not capable to enhance OVA-specific response in CD4+ T cells purified from OT-II mice. These findings significantly contribute to the understanding of the role of glycans in the immunomodulation elicited by bacterial SLPs and generate a great opportunity in the search for new adjuvants derived from non-pathogenic microorganisms.Fil: Malamud, Mariano. Universidad Nacional de La Plata. Facultad de Ciencias Exactas. Departamento de Ciencias Biológicas. Cátedra de Microbiología General; Argentina. University of Veterinary Medicine Hannover; Alemania. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Centro Científico Tecnológico Conicet - La Plata; ArgentinaFil: Carasi, Paula. Universidad Nacional de La Plata. Facultad de Ciencias Exactas. Departamento de Ciencias Biológicas. Cátedra de Microbiología General; Argentina. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Centro Científico Tecnológico Conicet - La Plata. Instituto de Estudios Inmunológicos y Fisiopatológicos. Universidad Nacional de La Plata. Facultad de Ciencias Exactas. Instituto de Estudios Inmunológicos y Fisiopatológicos; ArgentinaFil: Assandri, Matías Hernán. Universidad Nacional de La Plata. Facultad de Ciencias Exactas. Departamento de Ciencias Biológicas. Cátedra de Microbiología General; Argentina. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Centro Científico Tecnológico Conicet - La Plata; ArgentinaFil: Freire, Teresa. Universidad de la República; UruguayFil: Lepenies, Bernd. University of Veterinary Medicine Hannover; AlemaniaFil: Serradell, María de los Ángeles. Universidad Nacional de La Plata. Facultad de Ciencias Exactas. Departamento de Ciencias Biológicas. Cátedra de Microbiología General; Argentina. Universidad Nacional Arturo Jauretche; Argentin

Immunostimulation by Lactobacillus kefiri S-layer proteins with distinct glycosylation patterns requires different lectin partners

S-layer (glyco)-proteins (SLPs) form a nanostructured envelope that covers the surface of different prokaryotes and show immunomodulatory activity. Previously, we have demonstrated that the S-layer glycoprotein from probiotic Lactobacillus kefiri CIDCA 8348 (SLP-8348) is recognized by Mincle (macrophage inducible C-type lectin receptor) and its adjuvanticity depends on the integrity of its glycans. However, the glycan´s structure has not been described so far. Herein, we analyze the glycosylation pattern of three SLPs, SLP-8348, SLP-8321, and SLP-5818, and explore how these patterns impacts their recognition by Ctype lectin receptors (CLRs) and the immunomodulatory effect of the L. kefiri SLPs on antigen-presenting cells. HPAEC-PAD performed after β-elimination showed glucose as the major component in the O-glycans of the three SLPs, however, some differences in the length of hexose chains were observed. No N-glycosylation signals were detected in SLP-8348 and SLP-8321, but SLP5818 was observed to have two sites carrying complex N-glycans based on a site-specific analysis and a glycomic workflow of the permethylated glycans. SLP-8348 was previously shown to enhance LPS-induced activation on both RAW264.7 macrophages and murine BMDCs; we now show SLP-8321 and SLP-5818 have a similar effect regardless of the differences in their glycosylation patterns. Studies performed with BMDCs from CLR-deficient mice revealed that the immunostimulatory activity of SLP-8321 depends on its recognition by Mincle, whereas SLP-5818’s effects are dependent on SignR3 (murine ortholog of human DC-SIGN). These findings encourage further investigation of both the potential application of these SLPs as new adjuvants and the protein glycosylation mechanisms in these bacteria.Fil: Malamud, Mariano. Universidad Nacional de La Plata. Facultad de Ciencias Exactas. Departamento de Ciencias Biológicas. Cátedra de Microbiología General; Argentina. University of Veterinary Medicine Hannover; Alemania. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Centro Científico Tecnológico Conicet - La Plata; ArgentinaFil: Cavallero, Gustavo Javier. Consejo Nacional de Investigaciones Cientificas y Tecnicas. Oficina de Coordinacion Administrativa Ciudad Universitaria. Centro de Investigaciones en Hidratos de Carbono. Subsede del Centro de Investigaciones en Hidratos de Carbono | Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Centro de Investigaciones en Hidratos de Carbono. Subsede del Centro de Investigaciones en Hidratos de Carbono; ArgentinaFil: Casabuono, Adriana Cristina. Consejo Nacional de Investigaciones Cientificas y Tecnicas. Oficina de Coordinacion Administrativa Ciudad Universitaria. Centro de Investigaciones en Hidratos de Carbono. Subsede del Centro de Investigaciones en Hidratos de Carbono | Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Centro de Investigaciones en Hidratos de Carbono. Subsede del Centro de Investigaciones en Hidratos de Carbono; ArgentinaFil: Lepenies, Bernd. University of Veterinary Medicine Hannover; AlemaniaFil: Serradell, María de los Ángeles. Universidad Nacional de La Plata. Facultad de Ciencias Exactas. Departamento de Ciencias Biológicas. Cátedra de Microbiología General; Argentina. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Centro Científico Tecnológico Conicet - La Plata; ArgentinaFil: Couto, Alicia Susana. Consejo Nacional de Investigaciones Cientificas y Tecnicas. Oficina de Coordinacion Administrativa Ciudad Universitaria. Centro de Investigaciones en Hidratos de Carbono. Subsede del Centro de Investigaciones en Hidratos de Carbono | Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Centro de Investigaciones en Hidratos de Carbono. Subsede del Centro de Investigaciones en Hidratos de Carbono; Argentin

A globalização pós-Covid-19 e o medo dos outros. O que se segue?

O IDN Brief especial pandemia chega agora ao fim com um número dedicado ao impacto da COVID-19 na ordem mundial e nos equilíbrios geoestratégicos. Foram 9 edições, em que 90 especialistas partilharam as suas análises sobre os efeitos desta pandemia em múltiplas dimensões: da segurança sanitária à ação das forças armadas, da gestão de crises à segurança humana, da defesa Europeia à relação transatlântica, da cibersegurança aos equilíbrios de poder mundiais. Esta edição fecha com registos de diagnóstico e prospetiva sobre as dinâmicas da tensão e competição entre Estados Unidos e a China, o lugar da Europa e dos seus principais protagonistas, o espaço para o multilateralismo e o papel da ciência, a contradição entre o reforço dos interesses nacionais e as exigências de cooperação, a emergência, estabilidade ou irrelevância estratégica de diferentes espaços regionais, a produção do inimigo, a desconfiança e o medo dos outros. Continuaremos, com outros formatos e iniciativas, a acompanhar os cenários desta crise em desenvolvimento e de uma magnitude sem precedentes, na qual a expressão ‘saudades do futuro’ adquire um sentido muito particular, alimentando tanto visões pessimistas como demandas de ação e transformação.info:eu-repo/semantics/publishedVersio

Potentiality of Food-Isolated Lentilactobacillus kefiri Strains as Probiotics: State-of-Art and Perspectives

Lentilactobacillus kefri is one of the main lactic acid bacteria species in kefr and it was also isolated from other fermented foods. Numerous strains have been isolated and characterized regarding its potential as probiotics for the development of novel functional foods. To our knowledge this is the frst review focused on highlighting safety aspects and health beneficial effects reported for L. kefri strains. Several L. kefri strains lack of transmissible antibiotic resistance genes, are tolerant tothe harsh conditions of the gastrointestinal environment, and could resist diferent preservation procedures. Moreover, many of the isolated strains have shown antimicrobial activity against pathogens and their toxins, exhibited immunomodulatory activity as well as induced some benefcial efects at metabolic level. Regarding all the scientifc evidence, certain L. kefiri strains emerge as excellent candidates to be applied to the development of both food supplements and new fermented foods with health-promoting properties. However, the availability of genomic information is still very limited, so much more work must be done in order to explore the potentiality of L. kefiri as a probiotic and a source of bioactive metabolites.Fil: Carasi, Paula. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Centro Científico Tecnológico Conicet - La Plata. Instituto de Estudios Inmunológicos y Fisiopatológicos. Universidad Nacional de La Plata. Facultad de Ciencias Exactas. Instituto de Estudios Inmunológicos y Fisiopatológicos; ArgentinaFil: Malamud, Mariano. Universidad Nacional de La Plata. Facultad de Ciencias Exactas. Departamento de Ciencias Biológicas. Cátedra de Microbiología General; Argentina. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Centro Científico Tecnológico Conicet - La Plata; ArgentinaFil: Serradell, María de los Ángeles. Universidad Nacional de La Plata. Facultad de Ciencias Exactas. Departamento de Ciencias Biológicas. Cátedra de Microbiología General; Argentina. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Centro Científico Tecnológico Conicet - La Plata; Argentin

S-layer glycoprotein from Lactobacillus kefiri CIDCA 8348 enhances macrophages response to LPS in a Ca+2-dependent manner

The S-layer is a (glyco)-proteinaceous envelope constituted by self-assembled subunits that form a two-dimensional lattice covering the surface of different species of Bacteria and Archaea. It could be considered as one of the most abundant biopolymers in our planet. Because of their unique self-assembly features, exhibiting repetitive identical physicochemical properties down to the subnanometer scale, as well as their involvement in specific interactions with host cells, the S-layer proteins (SLPs) show a high potential application in different areas of biotechnology, including the development of antigen carriers or new adjuvants. The presence of a glycosylated SLP on potentially probiotic Lactobacillus kefiri strains was previously described by our research group. In this study, we aim to investigate the role of carbohydrates present in the SLP from L. kefiri CIDCA 8348 (SLP-8348) in their internalization by murine macrophages, as well as to analyze their immunomodulatory capacity and their effect on LPS-stimulated macrophages. RAW 264.7 cells internalized the SLP-8348 in a process that was mediated by carbohydrate-receptor interactions since it was inhibited by glucose, mannose or EGTA, a Ca+2 chelating agent. These results correlated with the recognition of SLP-8348 by ConA lectin. We further show that while SLP-8348 was not able to induce the activation of macrophages by itself, it favored the LPS-induced response, since there was a significant increase in the expression of surface cell markers MHC-II, CD86 and CD40, as well as in IL-6 and IL-10 expression at both transcript and protein levels, in comparison with LPS-stimulated cells. The presence of EGTA completely abrogated this synergistic effect. Taken together, these results strongly suggest the involvement of both glycosidic residues and Ca+2 ions in the recognition of SLP-8348 by cellular receptors on murine macrophages. Moreover, these results suggest the potentiality of the SLP-8348 for the development of new adjuvants capable of stimulating antigen presenting cells by interaction with glycan receptors.Fil: Malamud, Mariano. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Centro Científico Tecnológico Conicet - La Plata; Argentina. Universidad Nacional de la Plata. Facultad de Ciencias Exactas. Departamento de Ciencias Biológicas. Cátedra de Microbiología General; ArgentinaFil: Carasi, Paula. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Centro Científico Tecnológico Conicet - La Plata; Argentina. Universidad Nacional de la Plata. Facultad de Ciencias Exactas. Departamento de Ciencias Biológicas. Cátedra de Microbiología General; ArgentinaFil: Freire, Teresa. Universidad de la República; UruguayFil: Serradell, María de los Ángeles. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Centro Científico Tecnológico Conicet - La Plata; Argentina. Universidad Nacional de la Plata. Facultad de Ciencias Exactas. Departamento de Ciencias Biológicas. Cátedra de Microbiología General; Argentina. Universidad Nacional Arturo Jauretche; Argentin