Second und third harmonic generation imaging von Kopf-Hals-Tumoren

Das Ziel dieses Projektes war es, Unterschiede zwischen gesundem und maligne entartetem menschlichen Gewebe des Kopf-Hals-Bereiches mithilfe von Second und Third Harmonic Generation Imaging (SHG und THG) zu erkennen. Veränderungen der Kollagenstruktur und -menge in der Extrazellularmatrix standen dabei im Vordergrund. Es wurden Gewebeschnitte von verschiedenen Patienten mit Kopf-Hals-Tumoren sowie von gesunder Schleimhaut (n = 10) mit dieser Methode untersucht. SHG und THG sind nichtlineare optische Phänomene: zwei oder drei Photonen (in diesem Projekt typischerweise mit Wellenlängen ≥ 800 nm oder ≥ 1200 nm) werden kohärent an den Kollagenfibrillen der Extrazellularmatrix des Gewebes gestreut und bilden ein Photon mit höherer Harmonie, welches nun nur noch die halbe oder ein Drittel der ursprünglichen Wellenlänge besitzt. SHG und THG basieren auf endogenen Kontrasten und benötigen daher keine weiteren Färbungen des Gewebes. SHG entsteht an nicht-inversionssymmetrischen Strukturen, wie zum Beispiel verschiedenen Kollagen-Subtypen, THG hingegen entsteht an Membrangrenzen. Mit SHG können Veränderungen der Struktur und Zusammensetzung von Kollagenfasern mit hoher Sensitivität und Spezifität dargestellt werden. Mithilfe von THG ergeben sich Informationen über Zell-Zell- und auch Zell-Kollagen-Grenzen, Zellmembranen an sich können ebenfalls dargestellt werden. SHG und THG könnten als aussagekräftige Instrumente verwendet werden, um Karzinome in vivo zu erkennen, ohne das umgebende Gewebe zu schädigen. Da sie auf endogenen Kontrasten und geometrischen Eigenschaften von Gewebe basiert, verursacht diese Art der nichtlinearen Optik keine Schädigung des Gewebes durch Phototoxizität oder Bleichung. Die Gewebeproben wurden direkt nach der operativen Entfernung tiefgefroren, in ein OCT–(optimal cutting temperature) Gemisch eingebettet und mit einem Kryotom in vier Mikrometer dicke Proben geschnitten. Das Gewebe wurde anschließend sowohl mit konventionellen histologischen Methoden wie H.E. und Elastica van Gieson gefärbt, als auch immunhistologisch. Für die Immunhistologie wurde ein Kollagen-Typ 1-spezifischer Antikörper als primärer sowie ein biotinylierter anti-Maus-Antikörper als sekundärer Antikörper verwendet. Für die Untersuchung der gefärbten Schnitte wurde ein Lichtmikroskop benutzt. Nachfolgende Schnitte der Gewebe wurden lediglich mit Hämalaun angefärbt und mittels SHG- und THG-Bildgebung analysiert. Hierfür wurde ein Mehrphotonen-Mikroskop mit einem Titan-Saphir-Laser und einem optisch-parametrischem Oszillator verwendet. Die qualitative Bildanalyse verglich Kollagenfasern, die durch die Immunhistologie sichtbar gemacht wurden mit denen, die das SHG-Verfahren zeigte. Die quantitative Bildanalyse konzentrierte sich auf die Messung des Verhältnisses zwischen vorwärts und rückwärts gestreuten Signalen der histologischen Schnitte am Mehrphotonen-Mikroskop. Dieses Verhältnis, fSHG/bSHG, gibt Aufschluss über die Organisation und Dichte der Kollagenfibrillen. Acht von zehn Proben zeigten eine höhere f/b-Ratio im gesunden als im tumorösen Gewebe. Dies deutet auf einen geringeren Grad der Struktur von Tumorgewebe im Vergleich zu gesundem Gewebe hin. Eine höhere f/b-Ratio kann als eine höhere Ordnung von Kollagenfibrillen im betreffenden Gewebe interpretiert werden. Je höher die f/b-Ratio, desto weniger Streuereignisse von Photonen im Verlauf durch das Gewebe treten auf. Durch die vorwärts gerichteten Detektoren ergibt sich fSHG, also das Signal der durch das Gewebe reichenden Photonen. Rückwärts gerichtete Detektoren ermitteln gestreute Photonen. Lediglich zwei von zehn Proben wiesen eine höhere f/b-Ratio in Tumoren als in gesundem Gewebe auf. Diese zwei Proben zeigten bezüglich der Art des Tumors keine eindeutigen Unterschiede zu den anderen Proben. Es handelte sich jeweils um ein Oropharynx- und ein Hypoharynxkarzinom. Die anderen acht Gewebeproben waren ebenfalls entweder Oro-oder Hypopharynxkarzinome. Für THG wurde diese Art der Auswertung nicht durchgeführt, da die Interpretation der Ordnung speziell von Kollagenfibrillen nur mit SHG möglich ist. In dieser Arbeit liegt der Fokus auf Veränderungen von Kollagenfibrillen von gesundem hin zu Tumorgewebe. Kollagen wird spezifisch mittels SHG dargestellt. THG-Signale der Gewebeproben wurden jedoch dennoch generiert, um ein Gesamtbild des Gewebes zu erhalten. SHG und THG Imaging sind vielversprechende Werkzeuge zur Diagnostik und Therapie von Tumorerkrankungen. Hiermit können Änderungen innerhalb von Tumorgewebe nicht nur auf zellulärer Struktur, sondern auch im Bereich der Extrazellularmatrix erkannt und interpretiert werden. In vivo-Mikroskopie kann aufgrund der gewebeschonenden Eigenschaften einen hilfreichen Mehrwert in der Tumordiagnostik und -therapie erbringen.The project’s goal is to detect differences between healthy and malignant tissue of the human head and neck area by utilizing Second and Third Harmonic Generation Imaging (SHG and THG). The focus lies on changes in the structure and quantity of collagenous extracellular matrix. In this study, we assess post-surgical head and neck squamous cell carcinoma tissue from different patients as well as healthy tissue. SHG and THG are nonlinear optical phenomena: two or three photons (in practice with a wavelength of typically ≥800 nm or ≥1200 nm) are coherently scattered at the extracellular collagen matrix of the tissue to generate a higher harmonic photon with half or one third of the wavelength, respectively. SHG and THG rely on endogenous contrasts. SHG can image changes in the collagenous extracellular matrix structure and composition with great sensitivity and specificity as it emerges from non-centrosymmetric structures such as several collagen types. THG provides information on cell-cell as well as cell-collagen matrix integrity and visualizes cells as well as membrane borders. The sub-resolution fibrillar assembly is revealed through emission directionality. This information is inherent due to the coherence and phase-matching process of SHG. SHG and THG can present a powerful tool to detect carcinoma in vivo, without causing any harm to the surrounding tissue. We examined tissue from patients with head and neck squamous cell carcinoma and tissue from healthy mucosa (each n = 10). The post-surgical tissue samples were snap-frozen, embedded in OCT (optimal cutting temperature) compound and cut with a cryotome into four-micrometer thick samples. The samples were prepared for conventional histological staining procedures and conventional immunohistochemistry methods. The antibody used is specific for collagen-I-type and was combined with a biotinylated anti-mouse-antibody as secondary antibody. Normal light microscopy was utilized for analysis. Consecutive slides of the samples were stained only with hemalaun and analyzed via SHG imaging. A multiphoton microscope with an optical parametric oscillator was used. Qualitative imaging analysis compared collagen matrices detected via immunohistochemistry and SHG. Quantitative imaging analysis measured forward to backward intensity ratio (fSHG/bSHG) of SHG images. This ratio provides information on organization and density of the tissue. THG images were used to develop a holistic image of the tissue. Since THG visualizes membrane borders and cell-cell associations among other things, it was used to complement the overall image of the tissue. An f/b-ratio of THG images was not formed, the interest of f/b focuses on collagen and thus on SHG-signals. Our qualitative and quantitative assessments of the tissue samples demonstrate a structural change of collagen matrix organization from healthy to malignant tissue. Eight out of ten tissue samples showed a lower fSHG/bSHG in malignant compared to healthy tissue. This indicates a structural change of collagen matrix organization from healthy to malignant tissue. A lower f/b ratio indicates greater disorder of collagen fibrils in the tissue of interest. The lower the f/b ratio, the higher the number of scattering events of photons in the tissue. Thus, highly ordered collagen fibrils in tissue show a high f/b ratio. The assessed tissue samples showed a high f/b ratio in healthy tissue, describing highly organized tissue and few scattering events. In reverse, malignant tissue showed a low f/b ratio with many scattering events. This information can be used to broaden the in vivo diagnostic and therapeutic possibilities for HNSCC. Intravital imaging techniques are emerging and can provide a detailed view on the extracellular matrix without being harmful to the tissue. Such techniques can be coupled to existing fiber optic imaging devices and enhance pathology analysis of early stage HNSCC as well as real-time surgical determination of tumor margins. Thus, Second and Third Harmonic Generation Imaging provides broad possibilities to analyze not only the cellular but also the extracellular changes in diseased tissue

ToSkORL: Selbst- und Fremdeinschätzung bei der Untersuchung des Kopf-Hals-Bereichs

BACKGROUND A~central goal of medical school is acquisition of theoretical and practical competences. However, evidence on how capacity acquisition can be measured for special examination techniques is scarce. ToSkORL (Teaching of Skills in Otorhinolaryngology) is a project aimed at scientifically and didactically investigating students' self-evaluation skills in otorhinolaryngologic and head and neck examination techniques. METHODS During the examination techniques course, a~standardized oral and practical exam for nine different techniques was conducted. Using Likert scales, self-evaluation was based on questionnaires before the clinical skills exam and objective evaluation was performed by the examiners during the examination using a checklist. Self- and objective evaluation were correlated. Nine different examination skills were assessed 42~times each by a~total of 91~students. RESULTS Self-evaluation of competence in the different examination skills varied widely. Nevertheless, self- and objective evaluation correlated well overall, independent of age and gender. Students highly interested in otorhinolaryngology rated their own skills higher but tended toward overestimation. For examination items with intermediate difficulty, the highest divergences between self- and objective evaluation were found. CONCLUSION Student self-evaluations are an appropriate instrument for measuring competences in otorhinolaryngologic examinations. Instructors should focus on items with allegedly intermediate difficulty, which are most often over- and underestimated. ZUSAMMENFASSUNG HINTERGRUND: Ein zentrales Ziel des Medizinstudiums ist der Erwerb theoretischer und praktischer Kompetenzen. Es mangelt jedoch an Evidenz, wie der Erwerb von Kompetenzen in speziellen Untersuchungstechniken gemessen werden kann. ToSkORL (Teaching of Skills in Otorhinolaryngology) ist ein Projekt, das die studentische Selbstwahrnehmung ihrer Kompetenz bei speziellen Untersuchungstechniken der Hals-Nasen-Ohren-Heilkunde und des Kopf-Hals-Bereichs aus didaktisch-wissenschaftlicher Sichtweise beleuchtet. METHODIK Im Rahmen des Untersuchungskurses erfolgte eine standardisierte mündlich-praktische Prüfung zu neun verschiedenen Untersuchungstechniken. Vor der Prüfung erfolgte eine Evaluation der studentischen Selbsteinschätzung mittels Fragebogen, die Prüfung wurde mittels Checkliste durch die Prüfenden standardisiert geprüft. Selbst- und Fremdeinschätzung nach der Likert-Skala wurden korreliert. Die neun Untersuchungstechniken wurden jeweils 42-mal von insgesamt 91~Studierenden in gegenseitiger Untersuchung durchgeführt. ERGEBNISSE Die Selbsteinschätzung der Kompetenz in den Untersuchungstechniken variiert erheblich, insgesamt schätzten Studierende ihre eigene Untersuchungskompetenz weitgehend unabhängig von Alter und Geschlecht meist realistisch ein. Studierende mit einem hohen Interesse an der Hals-Nasen-Ohren-Heilkunde gaben bessere Selbsteinschätzungen an, neigten jedoch auch eher zur Selbstüberschätzung. Bei Untersuchungen des mittleren Schwierigkeitsniveaus ergab sich die größte Divergenz von Selbst- und Fremdeinschätzung. SCHLUSSFOLGERUNG Die studentische Selbsteinschätzung ist ein geeignetes Instrument zur Messung der Untersuchungskompetenz in der Hals-Nasen-Ohren-Heilkunde. Es sollte ein besonderer Fokus auf die Lehre vermeintlich mittelschwerer Untersuchungstechniken gelegt werden, da diese am stärksten über- und unterschätzt werden

Low-energy antikaon–nucleon/nuclei interaction studies by AMADEUS

The AMADEUS experiment deals with the investigation of the low energy kaon–nuclei hadronic interaction at the DAΦNE collider at LNF-INFN, which is fundamental to solve longstanding questions in the nonperturbative strangeness QCD sector. AMADEUS step 0 consisted in the reanalysis of the 2004/2005 KLOE data, exploiting K^− absorptions in H, ^4He, ^9Be and ^{; ; 12}; ; C, leading to the first invariant mass spectroscopy study with very low-momentum (100 MeV) in-flight K^− captures. With AMADEUS step 1, a dedicated pure carbon target was implemented in the central region of the KLOE detector, providing a high statistic sample of pure at-rest K^− nuclear interaction. The results obtained in the analyses of the hyperon–pion correlated events, searching for the resonant shapes of Y states, will be described

Low energy antikaon-nucleon/nuclei interaction studies by AMADEUS

The AMADEUS experiment at the DAΦNE collider of LNF-INFN deals with the investigation of the at-rest, or low-momentum, K− interactions in light nuclear targets, with the aim to constrain the low energy QCD models in the strangeness sector. The 0 step of the experiment consisted in the reanalysis of the 2004/2005 KLOE data, exploiting K− absorptions in H, 4He, 9Be and 12C, leading to the first invariant mass spectroscopic study with very low momentum (about 100 MeV) in-flight K− captures. With AMADEUS step 1 a dedicated pure Carbon target was implemented in the central region of the KLOE detector, providing a high statistic sample of pure at-rest K− nuclear interaction. The first measurement of the non-resonant transition amplitude $\left| {{A_{{K^ - }n \to \Lambda {\pi ^ - }}}} \right|$ at $\sqrt s = 33\,MeV$ below the K̄N threshold is presented, in relation with the Λ(1405) properties studies. The analysis procedure adopted in the serarch for K− multi-nucleon absorption cross sections and Branching Ratios will be also described

Main features of the SIDDHARTA-2 apparatus for kaonic deuterium X-ray measurements

The low-energy, non-perturbative regime of QCD can be studied directly by X-ray spectroscopy of light kaonic atoms. The SIDDHARTA-2 experiment, located at the DAΦNE collider, aims to measure the 2p $\to$ 1s transition in kaonic deuterium for the first time to extract the antikaon-nucleon scattering lengths. This measurement is impeded, inter alia, by the low K$^{-}$d X-ray yield. Hence, several updates have been implemented on the apparatus to increase the signal-to-background ratio, which are discussed in detail in this paper: a lightweight gas target cell, novel Silicon Drift Detectors for the X-ray detection with excellent performance, and a veto system for active background suppression. The experiment has undergone a first preparatory run during DAΦNE’s commissioning phase in 2021, concluding with a successful kaonic helium measurement

Spectroscopy of kaonic atoms at DAFNE and J-PARC

The interaction of antikaons (K^{-}) with nucleons and nuclei in the low-energy regime represents a very active research field in hadron physics. A unique and rather direct experimental access to the antikaon-nucleon scattering lengths is provided by precision X-ray spectroscopy of transitions in low-lying states in the lightest kaonic atoms (i.e. kaonic hydrogen and deuterium). In the SIDDHARTA experiment at the electron-positron collider DAFNE of LNFINFN we measured the most precise values of the strong interaction observables in conic hydrogen. The strong interaction on the 1s ground state of the electromagnetically bound K-p atom causes an energy shift and broadening of the 1s state. SIDDHARTA will extend the spectroscopy to kaonic deuterium to get access to the antikaon-neutron interaction and thus the isospin dependent scattering lengths. At J-PARC a kaon beam is used in a complementary experiment with a different setup for spectroscopy of kaonic deuterium atoms. The talk will give an overview of the of the upcoming experiments SIDDHARTA and the complementary experiment at J-PARC.Furthermore, the implications of the experiments for the theory of low-energy strong interaction with strangeness will be discussed

kaonic atoms experiment at the daφne collider by siddharta siddharta 2

The excellent quality kaon beam provided by the DA\PhiΦNE collider of LNF-INFN (Italy) together with SIDDHARTA/SIDDHARTA-2 new experimental techniques, as very precise and fast-response X-ray detectors, allow to perform unprecedented measurements on light kaonic atoms crucial for a deeper understanding of the low-energy quantum chromodynamics (QCD) in the strangeness sector. In this paper an overview of the main results obtained by the SIDDHARTA collaboration, as well as the future plans related to the SIDDHARTA-2 experiment, are discussed