Influence of phytoregulators and nitrogen sources on the in vitro morphogenesis of Chrysanthemum morifolium (Ramat) Tzvelev cv Amarelo São Paulo

O objetivo desse trabalho foi estudar o efeito de várias fontes de nitrogênio e de fitorreguladores na multiplicação e desenvolvimento de Chrysanthemum morifolium cv. Amarelo São Paulo, os quais vinham sendo mantidos por cerca de 2 anos em meio MS básico acrescido de 0,2 mg/L de BAP. No experimento com várias fontes de nitrogênio foram realizados oito tratamentos, sendo que em todos eles manteve-se constante a quantidade de nitrogênio total contida no meio MS (NT = 60, 00 mM), variando-se somente as fontes nitrogenadas. Não foram adicionados fitorreguladores em nenhum tratamento. O tratamento E1 consistiu-se do meio MS completo. Nos demais tratamentos, para obter-se NT (na mesma concentração de 60,00mM), as seguintes fontes nitrogenadas foram utilizadas: E2 = NH4+; E3 = NO3-; E4 = uréia - 100 mg/L + NO3-; E5 = uréia - 200 mg/L + NO3-; E6 = uréia; E7 = uréia + glutamina e E8 = glutamina. Os resultados evidenciam que a utilização de uréia substituindo a fonte amoniacal de nitrogênio no meio MS determinou maior desenvolvimento da parte aérea das plantas nos primeiros 35 dias após a instalação do experimento, favorecendo o enraizamento aos 70 dias. Também foram estudados os efeitos da interação entre os fitorreguladores BAP e AIA, nas seguintes concentrações: BAP: (0,0); (2,0); (4,0); (6,0); (8,0); (10,0) mg/l e IAA: (0,0); (O,1); (1,0); (10,0) mg/l. Os resultados revelaram que as plantas contidas em meio MS completo e em ausência total de fitorreguladores, fitorreguladores, obtiveram um excelente desenvolvimento tanto da parte aérea como de raízes, podendo-se concluir que para esse cultivar não há necessidade da adição de fitorreguladores exógenos. O efeito do etileno sobre o desenvolvimento dos explanes também foi analisado através da interação entre nitrato de prata (substância que tem ação competitiva ao etileno) e BAP. Observou-se que a presença de nitrato de prata, utilizada isoladamente ou interagindo com BAP, resultou em baixos valores das médias obtidas para todos os parâmetros analisados: altura do eixo principal, número de folhas, número de raízes, MMF e MMS. Isso sugere que a ausência de etileno influenciou negativamente o desenvolvimento das plantas cultivadas in vitro.The effect of different sources of inorganic and organic nitrogen and phytoregulators on the in vitro development of Chrysanthemum morifolium cv Amarelo São Paulo was the objective of the present work, using 2-year old plants maintained in MS basic medium plus 0,2 mg/L BAP starting plant material. When different sources of nitrogen were tested, the amount of total nitrogen (TN) was always constant (60 mM), the treatment E1 being the reference (complete MS). The following nitrogen sources were utilized: E2: NH4+; E3: NO3-; E4: urea (100 mg/L) + NO3-; E5: urea (200 mg/L) + NO3-; E6: urea; E7: urea + glutamine; E8: glutamine. The results showed that when urea replaced ammonium, a better shoot development was obtained in the first 35 days after the starting of the experiments, resulting in better rooting of the plants after 70 days. Interactions among BAP and IAA were tested, using the following concentrations of the phytoregulators: BAP (0,0); (2,0); (4,0); (6,0); (8,0) and (10,0) mg/L; IAA (0,0); (0,1); (1,0) and (10,0) mg/L. Shoot and roots of the chrysanthemum plants maintained in complete MS and absence of any of the phytoregulators showed an excellent development indicating that no phytoregulators can be added to the growth medium in order to help their growing. The effect of ethylene gas on the development of nodal explants has been observed through in interaction of BAP and silver nitrate (an ethylene competitor). It has been observed that silver nitrate alone or interacting with BAP, caused a decrease in the average figures of all analyzed parameters: height of the main plant axis, number of leaves and roots and fresh and dry weights, indicating that the absence of ethylene gas had a negative effect on the in vitro development of the chrysanthemum plants

Estabelecimento e cultura in vitro de raizes normais e transformadas com Agrobacterium rhizogenes para estudos de terpenos de interesse em genotipo superior de Artemisia annua L.

Orientador : Simone Liliane Kirszenzaft ShepherdTese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de BiologiaResumo: As plantas do gênero Artemisia se constituem numa rica fonte de sesquiterpenos, os quais têm recebido grande atenção dos pesquisadores devido a sua diversidade química e biológica. A contínua investigação da presença de compostos secundários de interesse bem como de protocolos eficientes para a viabilização e otimização da produção em larga escala dos mesmos são extremamente recomendados e necessários para a exploração desta rica fonte de novos agentes quimioterapêuticos e agriculturaís. A planta alvo deste estudo foi o florido CPQBA 2/39 x PL5 da espécie Artemisía annua, o qual foi obtido pelo programa de melhoramento genético da MEDIPLANT e do CPQBA. Com a finalidade de se manter algumas características desejáveis deste genótipo superior, tais como alta produção de biomassa e de artemisinina, um sesquiterpeno com ação antimalárica, o presente trabalho teve início a partir de um único explante meristemático, o qual foi excisado de uma única planta matriz do híbrido melhorado cultivada nos campos experimentais do CPQBA. Após o desenvolvimento do explante meristemático selecionado, este foi micropropagado até a obtenção de um banco de material homogêneo in vitro com número adequado de plantas sadias, as quais serviram como fontes de explantes para os experimentos posteriores. Foram desenvolvidas metodologias para a iniciação, estabelecimento e cultivo de raízes tanto normais como transformadas com duas cepas de Agrobacterium rhizogenes (15834 e 8196). A confirmação do caráter transgênico das raízes foi obtida por "Dot Blot", um método rápido e eficiente de triagem que permitiu uma análise molecular qualitativa. Estudos relacionados com a formação de calos e a morfogênese in vitro das raízes transformadas obtidas com ambas as cepas também foram realizados. Os extratos dos materiais vegetais foram analisados por cromatografia gasosa acoplado a um espectrômetro de massas (CGIEM) de acordo com metodologia analítica e de alta sensibilidade para detecção de terpenos que foi desenvolvida por pesquisadores do CPQBAlUNICAMP. Os extratos dos calos obtidos bem como das raízes transformadas e normais estabelecidas e cultivadas em diferentes meios de cultura e sobre diferentes condições fotoperiódicas foram analisados quimicamente para a avaliação de alguns terpenos de interesse, tais como: artemisinina e ácido artemisinínico, além de dois outros compostos com forte atividade antiulcerogênica: dihídro-epideoxí-artenuína B edeoxiartemisinína. Os resultados destas análises revelaram que nenhum dos terpenos mencionados estavam presentes nos extratos dos calos e das raízes transformadas analisadas. Os cromatogramas dos extratos das raízes normais cultivadas em meio MS líquido desprovido de fitorreguladores revelaram a presença do composto antiulcerogêníco dihídro-epideoxi artenuína B e de um outro composto ainda não identificado. Pelas características do padrão de ttacionamento do espectro obtido por CG/EM, podemos sugerir que este composto não identificado é também um terpeno, no entanto a confirmação desta hipótese deverá ser objetivo de trabalhos futuros. As condições fotoperiódícas de cultivo influenciaram na produção destes dois terpenos, sendo que a produção do composto não identificado foi inversamente proporcional à produÇão de dihídro-epideoxí-artenuína B, ou seja, sob condição de escuro contínuo, quando díhidro-epideoxi-artenuína B foi intensamente produzido, o composto não identificado foi detectado em pequenas proporções, e, sob fotoperíodo de 16 horas, o inverso ocorreu. A quantificação de dihídro-epideoxi-artenuína B por Cromatografia gasosa acoplado a um Detector de Ionização de Chamas (CG/DIC) revelou um aumento de aproximadamente cinco vezes na produção deste composto pelas raízes normais cultivadas sob condição de escuro contínuo em relação às raÍzes cultivadas na presença de 16 horas de luz. A presença de auxína no meio MS mantido sob condições de 16 horas de luz resultou em alta produção do composto não identificado pelas raizes normais, enquanto que a produção de dihidro-epideoxi-artenuína B não foi detectada nestas raízes através das metodologias empregadas. Os terpenos de interesse também foram estudados quanto as suas atividades antimicrobianas através de ensaios bioautográficos. Para os testes biológicos foram utilizados os seguintes microrganismos: Bacillus subtilis, Salmonella hoterasuis, Micrococcus luteus, Rhodococcus equi, Escherichía colí, Staphylococcus aureus, Candida albícans, Pseudomonas aeruginosa. Os resultados destes testes mostraram que nenhum dos terpenos de interesse apresentou atividade antifúngica com a linhagem de Ccmdida a/bicans. A atividade antibacteriana foi comprovada para artemisinina e para o ácido artemisinínico, com as linhagens das bactérias B. subitílís, R equí, S. aureus e E. coZi. O composto dihidro-epideoxi artenuína B apresentou atividade antibacteriana com as linhagens das bactérias B. subtil is, M luteus e S. aureus e o composto deoxiartemisinina com as linhagens B. subtilis, R equi, M luteus e S. aureusAbstract: Plants of the Artemisia genera are a rich source of sesquíterpenes, whích have received great attentíon flOm researchers due to theírits bíologícal and chemícal diversíty. The continued investigation of the presence of secondary compounds is hígh1y recommended and necessary for the exploration of this rich source of new chemotherapeutic and agricultural agents. The plant targeted ín this study was the CPQBA 2/39 x PL5 hybrid of the A. annua specíes, obtaíned through the genetíc ímprovement plOgram of Jv1EDIPLANT and CPQBA. With the intent ofkeeping some ofthe desirable characteristícs ofthis superior genotype, such as high production of biomass and artemisinin, a sesquiterpene with antímalarial plOperties, the present study began with a síngle meristematíc explant, excísed from a síngle ímplOved hybrid matrix plant cultívated ín CPQBA's experimental fields. Afier the development of the selected meristematic explant, it was micropropagated until an in vitro homogenous material bank was obtained with a adequa te number of healthy plants, which served as explant sources for later experiments. Methodologies were developed for the estabIíshment and cultivation of roots, both normal and transformed wíth two straíns of Agrobacterium rhizogenes (15834 and 8196). The confirmation of the transgenic nature of the roots was obtained by the "Dot Blot" technique, a fast and efficient screening method that allows a qualitative molecular analysis. Studíes related to the formatíon of callus and the in vitro morphogenesís of the transformed lOots obtaíned wíth both straíns were also undertaken. The plant material extracts were I analyzed by Gasos Chrmatography acopladed to Spectrum Mass (GCIMS) according to the analytical methodology incorporating high sensitivity terpene detection developed by CPQBAlUNICAMP researchers. The callus extracts as weIl as the transformed and normal roots establíshed and cultívated ín different culture media under different photoperiodic condítions were chemicaIly analysed for evaluation of relevant terpenes, such as: artemisinin, artemisiníc acid, as well as two other compounds wíth strong antíulcerogenic actívity: dihydro-epideoxi-artenuin B and deoxiartemisinin. The analysis of results revealed that none of the afore mentíoned terpenes were present in the callus extracts or transformed roots. The chromatograms of the extracts taken úom normal roots cultivated in MS liquid medium deprived of phytoregulators revealed the presence of the antiulcerogenic compound dihydro epideoxi-artenuin B and another as yet unidentified compound. The characteristics of the mass fractíoning pattem observed on GC/MS suggest that this unidentífied compound is also a terpene, however confirmation of this hypothesis requises further studies. Photoperiod during cultívatíon ínfluenced the productíon of both these terpenes, wíth the productíon of the unidentified compound beíng inversely proporcional to the production of dihidro-epideoxi artenuin B. Under continuous darkness dihidro-epideoxi-artenuin B was intensely produced and the unidentified compound present in small proportions, whereas the inverse ocurred in a 16 hour photoperiod The quantificatíon of dihydro-epídeoxi-artenuin B by Gasos Chromatography acopladed to Flame Ionization Detector (CG/FID) revealed as approximately fivefold increase in the production of this compound by normal roots cultívated under continuous darkness compared to roots cultivated in the presence of 16 hour of light. The presence of auxin in the MS medium maintained under 16 hour of light resulted in substantial production of the unidentífied compound by normal roots, while the production of dihidro epideoxi-artenuin B was not detected in these roots by the methods employed. The relevant terpenes were also studied with regard to their antimicrobial properties through bíoautographic tests. For such tests the foIIowíng microorganisms were used: o....I Baci/lus subtilis, Salmonella choterasuis, Micrococcus luteus, Rhodococcus equi, Escheríchía colí, Staphylococcus aureus, Candída albícans, Pseudomonas aerugínosa. The results of these tests showed that none of the relevant terpenes presented antifungaI activíty wíth the Candida albicans líne. The antíbacterial activíty was confirmed for rtemisinin and artemisinic acid, using B. subti/is, R equi, S. aureus, and E. co/i Unes. The compound dihydro-epídeoxi-artenuin B showed antíbacterial actívity with the bacterial lines B. subítílis, M [uteus, and S. aureus and the compound deoxiertemisinin with the Unes B. subitilis, R. equi, M [uteus, and S. aureusDoutoradoDoutor em Biologia Vegeta

Influência de fontes de nitrogênio sobre o desenvolvimento das gemas axilares de explantes caulinares de Chrysanthemum morifolium Ramat. cultivado in vitro

The effect of different nitrogen sources on the induction and rooting of axillary shoots in Chrysanthemum morifolium was tested. The total nitrogen concentration was maintained constant (60 mM) in all treatments, only the nitrogen source varying. Treatment E1 was a complete MS (Murashige & Skoog 1962) medium. The remaining treatments were: E2 = ammonium; E3 = nitrate; E4 = nitrate+urea (1.65 mM); E5 = nitrate+urea (3.33 mM); E6 = urea; E7 = urea+ glutamine, and E8 = glutamine. No phytohormones were added to the media. In treatment E1, both shoot and root development were promoted. The use of nitrate as the only source of nitrogen (treatment E3) was sufficient to maintain vigorous growth and no significant difference was found in any of the parameters measured when compared with the basic MS medium. The presence of urea promoted root development in Chrysanthemum, especially when used in addition to nitrate (treatments E4 and E5), hereby producing a dense root system. Both glutamine (treatment E7) and ammonium (treatment E2) were inefficient when used as the sole nitrogen source. Both of these sources resulted in a less vigorous plant growth, this being reflected in lower values for all of the parameters measured.Foram testadas diferentes fontes de nitrogênio na indução e enraizamento de brotações axilares de Chrysanthemum morifolium. Manteve-se constante o teor de nitrogênio total (60 mM) em todos os tratamentos realizados, variando-se apenas as fontes nitrogenadas. O tratamento E1 constituiu-se do meio MS (Murashige & Skoog 1962) completo. Os demais tratamentos foram: E2 = amônio; E3 = nitrato; E4 = nitrato+uréia (1,65 mM); E5 = nitrato+uréia (3,33 mM); E6 = uréia; E7 = uréia+glutamina e E8 = glutamina. Em nenhum tratamento foram adicionados fitorreguladores. No tratamento E1 houve um favorecimento de desenvolvimento de plantas de crisântemo in vitro tanto da parte aérea como de raízes. Porém, a utilização apenas de nitrato como única fonte de nitrogênio (tratamento E3) foi suficiente para sustentar o desenvolvimento das plantas, pois, para a maioria dos parâmetros analisados não foi observada diferença significativa em relação às plantas mantidas no meio básico de MS. A presença de uréia no meio de cultura incrementou o desenvolvimento de raízes de crisântemo, principalmente quando utilizada em adição ao nitrato (tratamentos E4 e E5), proporcionando um sistema radicular bastante denso. Quando utilizadas como única fonte de nitrogênio, tanto a glutamina (tratamento E7) como o íon amônio (tratamento E2) não se mostraram eficientes. O resultado do uso das fontes mencionadas foi um baixo desenvolvimento das plantas, como evidenciado pelos baixos valores de crescimento obtidos em todos os parâmetros analisados.141147Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq

Micropropagação de Zantedeschia spp.: otimização do processo produtivo

A produção de flores constitui-se em enorme potencial ao Agribusiness brasileiro. No entanto, para se ter acesso ao competitivo mercado de flores, é necessário vencer algumas barreiras. Uma das encontradas para a expansão de algumas espécies ornamentais, a exemplo de Zantedeschia spp., é a inexistência de protocolos eficientes de micropropagação visando à produção de mudas sadias em escala comercial e a um preço competitivo. O objetivo deste trabalho foi desenvolver protocolo específico para micropropagação da cultivar Neroli tendo em vista a otimização do processo produtivo para ganho de escala e qualidade fitossanitária das mudas obtidas. Para tanto, utilizaram-se os seguintes sistemas de esterilização de meios de cultura: a) sistema tradicional com o uso de autoclave e frascos de vidro como recipientes e b) sistema semi-automatizado no qual o meio de cultura é esterilizado em máquina especial (esterilizador de meio de cultura) e distribuído em dois diferentes potes de plástico esterilizados por plasma: 1) com filtro inserido na tampa e 2) sem filtro inserido na tampa. Compararam-se protocolos de esterilização dos explantes, método de isolamento dos explantes meristemáticos, composição nutricional e composição de fitorreguladores dos meios de cultura. O desenvolvimento do sistema semi- automatizado proposto combinado com 4,44 µM de benzilaminopurina (BAP) e uso de potes plásticos com filtro inserido nas tampas aumentaram a eficiência da micropropagação mensurada pelo comprimento médio das plântulas (5,75 ± 0,22), pelo número médio de brotos obtidos por explantes (2,56 ± 0,25) e pelo número médio de raízes (7,22 ± 0,31). O protocolo obtido pode auxiliar na redução dos custos desta ornamental, viabilizando-a comercialmente

Agrobacterium-mediated transformation of Jatropha curcas leaf explants with a fungal chitinase gene

Jatropha curcas L. oil has been shown to be suitable for the production of biodiesel. However, this species has not been domesticated yet. Genetic breeding through conventional methods is time consuming and costly, hence, genetic transformation could contribute positively to the improvement of interesting traits. Although in vitro regeneration and stable genetic transformation has been pursued for several years, variation in transformation efficiency remains strongly genotype-dependent and indicates that protocols optimization is still needed. Thus, this study was carried out to introduce a chitinase gene from the Trichoderma viride fungus into the genome of a J. curcas superior genotype by inoculating leaf explants with Agrobacterium tumefaciens EHA 105 strain in axenic conditions. Some key parameters such as pre-culture period and antibiotic doses were optimized with 500 mg.L-1 cefotaxime and 100 mg.L-1 kanamycin concentrations being suitable for A. tumefaciens inhibition and explant selection, respectively. The best transformation efficiency (50%) was obtained when leaf explants were incubated on a culture medium promoting shoot regeneration at 15 days before the induction of the transformation process. Plants where chitinase gene amplicons could be detected were assessed for transgene copy number and expression levels by quantitative real-time polymerase chain reaction (PCR). One, two and three copies of the introduced gene were confirmed in nine transgenic lines with two of them that were assessed for gene expression and showed quantitative variation for this variable. These results bring valuable information for further gene insertions in breeding programs of J. curcas for fungal disease resistance.Key words: Agrobacterium tumefaciens, pre-culture time, kanamycin, quantitative real-time polymerase chain reaction (PCR), transgene copy number

Agrobacterium - mediated transformation of Jatropha curcas leaf explants with a fungal chitinase gene

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