Organisation de composants de la sécrétion dans Bacillus subtilis

La membrane bactérienne a fait l'objet de nombreuses études de localisation de protéines et de phospholipides. Par fusion d’une protéine fluorescente (GFP) aux gènes d’intérêt, il est alors possible d‘observer la localisation des protéines associées par microscopie. La plupart de ces observations ont été réalisées à l’aide de microscopes dits à épifluorescence. Afin d’obtenir une qualité d’image suffisante, il était nécessaire de surexprimer la protéine observée, insérée à un locus ectopique non naturel. Ce travail de thèse a permis d’utiliser une nouvelle technologie acquise dans notre laboratoire, le microscope à fluorescence par réflexion totale interne (TIRFM), plus puissant que le microscope à épifluorescence utilisé précédemment. Cette technologie a permis une caractérisation plus détaillée de la localisation de protéines d’intérêt, placées sous contrôle de leur promoteur naturel. Il a également été possible de caractériser la dynamique des foci observés. Nous avons concentré notre étude sur 3 protéines: (i) SecA pour l’étude de la translocation des protéines du cytoplasme vers la membrane, (ii) YidC pour l’insertion des protéines dans la membrane, (iii) PgsA pour la synthèse des phospholipids. Les foci se déplacent dynamiquement et s’associent de manière transitoire dans la membrane. L’observation sur la durée de ces foci, et l’analyse de leur intensité moyenne au cours des observations, montre que SecA se déplace sur l’ensemble de la membrane de manière uniforme. L’analyse du déplacement des foci montre une relation quadratique entre la distance moyenne parcourue par les foci en fonction du temps. Ce résultat est en accord avec l’hypothèse d’un mouvement brownien des foci. Les foci sont observés dans les différentes phases de croissance des cellules, et le nombre de foci présents dans une cellule de la longueur de celle-ci. SecA-GFP a été testés dans un certain nombre de contextes génétiques. La localisation a été perturbée lors de la déplétion de pgsA. Cependant, comme PgsA est une protéine essentielle, il ne peut être exclu que ce changement de localisation apparaît des cellules qui sont mortes ou mourantes. Dans une souche mutante ΔclsA, on n’observe aucune différence dans la localisation de SecA en phase exponentielle, mais on aperçoit une relocalisation aux poles en phase stationnaire de croissance. La voie Tat est responsable du transport des protéines devant être exportées dans un état structuré, par exemple dans le cas de l’incorporation d’un co-facteur. À ce jour, la régulation du système Tat est peu connues, de même que les interactions entre les différentes sous-unités du système Tat et d'autres protéines dans le cytoplasme, dans la membrane ou dans la paroi cellulaire. Des fusions de les gènes de la voie Tat ont été co-exprimées deux à deux dans des cellules de levure, et leur capacité à interagir in vivo a été testée par la méthode dite du double hybride chez la levure. Nous avons généré un réseau d’interaction autour des cinq composants de système Tat. Pour déterminer les implications fonctionnelles des composants du réseau, nous avons travaillé en collaboration avec le laboratoire de Jan-Maarten van Dijl. Nous avons utilisé une collection de souches mutantes pour lesquels certains composants individuels du réseau ont été retires. Trois a été observe d’etre nécessaires pour la sécrétion Tat-dépendante. Nous avons étudié la localisation des fusions GFP avec ces proteins. On a observé une localisation double de HemAT selon l’état physiologique de la cellule. En phase exponentielle, les cellules de B. subtilis sont généralement présentes sous forme de chaînes dans lesquelles le septum de division a déjà été formé, mais la séparation cellulaire n'a pas encore eu lieu. Une fusion de la GFP à CsbC apparaît de façon homogène dans la membrane.In the years since the cloning of GFP, the field of bacterial cell biology has characterized a variety of specific protein localization patterns in the bacterial membrane. The vast majority of early subcellular localization studies made use of inducible GFP fusions, which generally required the presence of high concentrations of inducer, and can therefore be considered to be overexpressed. An outstanding question remains over the organization of natively expressed proteins in the membrane. Here, we have investigated the localization of functional GFP fusions to proteins catalyzing important membrane processes; the secretion motor protein SecA, the membrane insertase YidC1, and the essential phospholipid synthase PgsA using total internal reflection fluorescence microscopy (TIRFM). This allowed natively expressed proteins to be localized with temporal resolution that can capture their dynamics. We characterized dynamic complexes dispersed throughout the membrane displaying diffusive movement with no preferred trajectories. Further characterization focused upon identifying conditions in which the localization pattern was disturbed. A polar mislocalization was identified in a cardiolipin mutant strain. The yeast two-hybrid (Y2H) approach is a robust approach to detect binary interactions on a proteome-scale. We performed genome-wide Y2H screens as well as targeted Y2H analyses for specific interactions involving components of the Sec and Tat secretion machineries of B. subtilis, revealing an intricate protein-protein interaction network involving 71 proteins. Furthermore, three proteins identified in the Tat network, WprA, CsbC and HemAT, were shown to be important for effective protein secretion via the B. subtilis Tat system, indicating that our yeast two hybrid assays reveal biologically significant interactions involving membrane proteins. The studies provide a novel proteomic view on the interaction network of the secretion systems of B. subtilis

Organisation de composants de la sécrétion dans Bacillus subtilis

La membrane bactérienne a fait l'objet de nombreuses études de localisation de protéines et de phospholipides. Par fusion d une protéine fluorescente (GFP) aux gènes d intérêt, il est alors possible d observer la localisation des protéines associées par microscopie. La plupart de ces observations ont été réalisées à l aide de microscopes dits à épifluorescence. Afin d obtenir une qualité d image suffisante, il était nécessaire de surexprimer la protéine observée, insérée à un locus ectopique non naturel. Ce travail de thèse a permis d utiliser une nouvelle technologie acquise dans notre laboratoire, le microscope à fluorescence par réflexion totale interne (TIRFM), plus puissant que le microscope à épifluorescence utilisé précédemment. Cette technologie a permis une caractérisation plus détaillée de la localisation de protéines d intérêt, placées sous contrôle de leur promoteur naturel. Il a également été possible de caractériser la dynamique des foci observés. Nous avons concentré notre étude sur 3 protéines: (i) SecA pour l étude de la translocation des protéines du cytoplasme vers la membrane, (ii) YidC pour l insertion des protéines dans la membrane, (iii) PgsA pour la synthèse des phospholipids. Les foci se déplacent dynamiquement et s associent de manière transitoire dans la membrane. L observation sur la durée de ces foci, et l analyse de leur intensité moyenne au cours des observations, montre que SecA se déplace sur l ensemble de la membrane de manière uniforme. L analyse du déplacement des foci montre une relation quadratique entre la distance moyenne parcourue par les foci en fonction du temps. Ce résultat est en accord avec l hypothèse d un mouvement brownien des foci. Les foci sont observés dans les différentes phases de croissance des cellules, et le nombre de foci présents dans une cellule de la longueur de celle-ci. SecA-GFP a été testés dans un certain nombre de contextes génétiques. La localisation a été perturbée lors de la déplétion de pgsA. Cependant, comme PgsA est une protéine essentielle, il ne peut être exclu que ce changement de localisation apparaît des cellules qui sont mortes ou mourantes. Dans une souche mutante clsA, on n observe aucune différence dans la localisation de SecA en phase exponentielle, mais on aperçoit une relocalisation aux poles en phase stationnaire de croissance. La voie Tat est responsable du transport des protéines devant être exportées dans un état structuré, par exemple dans le cas de l incorporation d un co-facteur. À ce jour, la régulation du système Tat est peu connues, de même que les interactions entre les différentes sous-unités du système Tat et d'autres protéines dans le cytoplasme, dans la membrane ou dans la paroi cellulaire. Des fusions de les gènes de la voie Tat ont été co-exprimées deux à deux dans des cellules de levure, et leur capacité à interagir in vivo a été testée par la méthode dite du double hybride chez la levure. Nous avons généré un réseau d interaction autour des cinq composants de système Tat. Pour déterminer les implications fonctionnelles des composants du réseau, nous avons travaillé en collaboration avec le laboratoire de Jan-Maarten van Dijl. Nous avons utilisé une collection de souches mutantes pour lesquels certains composants individuels du réseau ont été retires. Trois a été observe d etre nécessaires pour la sécrétion Tat-dépendante. Nous avons étudié la localisation des fusions GFP avec ces proteins. On a observé une localisation double de HemAT selon l état physiologique de la cellule. En phase exponentielle, les cellules de B. subtilis sont généralement présentes sous forme de chaînes dans lesquelles le septum de division a déjà été formé, mais la séparation cellulaire n'a pas encore eu lieu. Une fusion de la GFP à CsbC apparaît de façon homogène dans la membrane.In the years since the cloning of GFP, the field of bacterial cell biology has characterized a variety of specific protein localization patterns in the bacterial membrane. The vast majority of early subcellular localization studies made use of inducible GFP fusions, which generally required the presence of high concentrations of inducer, and can therefore be considered to be overexpressed. An outstanding question remains over the organization of natively expressed proteins in the membrane. Here, we have investigated the localization of functional GFP fusions to proteins catalyzing important membrane processes; the secretion motor protein SecA, the membrane insertase YidC1, and the essential phospholipid synthase PgsA using total internal reflection fluorescence microscopy (TIRFM). This allowed natively expressed proteins to be localized with temporal resolution that can capture their dynamics. We characterized dynamic complexes dispersed throughout the membrane displaying diffusive movement with no preferred trajectories. Further characterization focused upon identifying conditions in which the localization pattern was disturbed. A polar mislocalization was identified in a cardiolipin mutant strain. The yeast two-hybrid (Y2H) approach is a robust approach to detect binary interactions on a proteome-scale. We performed genome-wide Y2H screens as well as targeted Y2H analyses for specific interactions involving components of the Sec and Tat secretion machineries of B. subtilis, revealing an intricate protein-protein interaction network involving 71 proteins. Furthermore, three proteins identified in the Tat network, WprA, CsbC and HemAT, were shown to be important for effective protein secretion via the B. subtilis Tat system, indicating that our yeast two hybrid assays reveal biologically significant interactions involving membrane proteins. The studies provide a novel proteomic view on the interaction network of the secretion systems of B. subtilis.PARIS11-SCD-Bib. électronique (914719901) / SudocSudocFranceF

Dynamic Organization of SecA and SecY Secretion Complexes in the <i>B</i>. <i>subtilis</i> Membrane

<div><p>In prokaryotes, about one third of cellular proteins are translocated across the plasma membrane or inserted into it by concerted action of the cytoplasmic ATPase SecA and the universally conserved SecYEG heterotrimeric polypeptide-translocating pore. Secretion complexes have been reported to localize in specific subcellular sites in <i>Bacillus subtilis</i>. In this work, we used a combination of total internal reflection microscopy, scanning fluorescence correlation spectroscopy, and pair correlation function to study the localization and dynamics of SecA and SecY in growing <i>Bacillus subtilis</i> cells. Both SecA and SecY localized in transient and dynamic foci in the cytoplasmic membrane, which displayed no higher-level organization in helices. Foci of SecA and SecY were in constant flux with freely diffusing SecA and SecY molecules. Scanning FCS confirmed the existence of populations of cellular SecA and SecY molecules with a wide range of diffusion coefficients. Diffusion of SecY as an uncomplexed molecular species was short-lived and only local while SecY complexed with its protein partners traversed distances of over half a micrometer in the cell.</p></div

pCF analysis of SecA-GFP and GFP-SecY.

<p><b>A.</b> pCF(6) for a typical cell expressing SecA-GFP with the times characteristic for various diffusive species shown on the right of the graph. <b>B.</b> pCF(6) for a typical cell expressing GFP-SecY with the times characteristic for various diffusive species shown on the right of the graph. <b>C.</b> Average pCF(6) for panel A. <b>D.</b> Average pCF(6) for panel B.</p

ACF analysis of SecA-GFP, GFP-SecY, and GFP.

<p><b>A, B,</b> and <b>C.</b> Autocorrelation function (ACF) carpets for a typical exponentially growing <i>B</i>. <i>subtilis</i> cell expressing SecA-GFP <b>(A)</b>, GFP-SecY (strain amyE::pGY1) <b>(B)</b>, and cytoplasmic GFP <b>(C).</b> For all panels the amplitude of the autocorrelation function in each pixel is shown as a heat map (32 pixels, 80 nm each) plotted against a logarithmic time lag.</p

Dynamics of SecA-GFP imaged by TIRF.

<p>SecA-GFP (strain secA::pSAG2) imaged by TIRFM. Time series were taken over 2 min in streaming mode using 100 ms integration time. A typical cell is displayed with ‘physics’ LUT from FIJI (see Materials and Methods). <b>A.</b> 100 ms snapshot. <b>B.</b> and <b>C.</b> Typical 3 s <b>(B)</b> and 2 min <b>(C)</b> maximum projections showing average localization of SecA-GFP over these timescales. The outline of the cells is shown above the panels (see Materials and Methods). The intensity scale for fluorescence is shown on the right of the cell outline panel; it also serves as a scale bar of 1 μm. <b>D.</b> Successive frames of the first cell on the left from panel A over a 700 ms time window. The top panel is the cell outline. Intensity scale for fluorescence is 1 μm. <b>E.</b> Fluorescence intensity profiles along the line drawn over the long axis of the cell shown for frames 1 and 7, as shown in blue and red respectively in panel D. <b>F.</b> Integrated fluorescence intensities for the entire surface of representative cells expressing SecA-GFP (in red) and GFP stably attached to the membrane via the membrane binding tail of MinD (MinDtail-GFP, in black) (see also <a href="http://www.plosone.org/article/info:doi/10.1371/journal.pone.0157899#pone.0157899.s001" target="_blank">S1</a> and <a href="http://www.plosone.org/article/info:doi/10.1371/journal.pone.0157899#pone.0157899.s003" target="_blank">S3</a> Figs).</p

Model of the secretory machinery.

<p>The SecYEG translocon (in green) is comprised SecYEG molecules which are engaged in cycles of association and dissociation with the SecY molecules on the membrane (a). SecA (shown in blue) delivers the pre-protein (shown in red) destined for export across the membrane to the translocon, where multiple molecules of SecA associate and accumulate during translocation. This association is dynamic because molecules of SecA exchange with the surrounding free molecules on the membrane (b) and in the cytoplasm (c). The SecYEG heterotrimer moves between neighboring translocons only when complexed with other proteins, such as SecA (d). A single SecA molecule can sequentially engage with neighboring SecYEG complexes (e).</p

Dynamics of GFP-SecY on the membrane.

<p>Distribution of GFP-SecY on the membrane of exponentially growing <i>B</i>. <i>subtilis</i> cells. Strain amyE::pGY1 (<i>amyE pxyl-gfp-secY spc</i>) was grown in LB in the presence of 0.05% xylose. Time series were taken over 1 min in streaming mode using 100 ms integration time. A typical cell is displayed with ‘physics’ LUT from FIJI (see Materials and Methods). <b>A.</b> 100 ms exposure TIRF image, <b>B.</b> and <b>C.</b> maximum projection of a 3 s (<b>B</b>) time window and <b>(C)</b> 1.5 min time window. The cell outlines are shown above the panels (see Materials and Methods). <b>D.</b> Cell outline and successive frames from a time-lapse TIRF acquisition taken in streaming mode. Intensity scale for fluorescence, 1 μm. <b>E.</b> Fluorescence intensity profiles along the line drawn over the long axis of the cell for frames 1 and 7, as shown in blue and red respectively, panel G. <b>F.</b> Integrated fluorescence intensities for the entire surface of the cell for the frames shown in panel D.</p