Trends and Challenges in Experimental Macromolecular Crystallography

Macromolecular X-ray crystallography underpins the vigorous field of structural molecular biology having yielded many protein, nucleic acid and virus structures in fine detail. The understanding of the recognition by these macromolecules, as receptors, of their cognate ligands involves the detailed study of the structural chemistry of their molecular interactions. Also these structural details underpin the rational design of novel inhibitors in modern drug discovery in the pharmaceutical industry. Moreover, from such structures the functional details can be inferred, such as the biological chemistry of enzyme reactivity. There is then a vast number and range of types of biological macromolecules that potentially could be studied. The completion of the protein primary sequencing of the yeast genome, and the human genome sequencing project comprising some 105 proteins that is underway, raises expectations for equivalent three dimensional structural database

Structural evidence for the partially oxidized dipyrromethene and dipyrromethanone forms of the cofactor of porphobilinogen deaminase: structures of the Bacillus megaterium

The enzyme porphobilinogen deaminase (PBGD; hydroxymethylbilane synthase; EC 2.5.1.61) catalyses an early step of the tetrapyrrole-biosynthesis pathway in which four molecules of the monopyrrole porphobilinogen are condensed to form a linear tetrapyrrole. The enzyme possesses a dipyrromethane cofactor, which is covalently linked by a thioether bridge to an invariant cysteine residue (Cys241 in the Bacillus megaterium enzyme). The cofactor is extended during the reaction by the sequential addition of the four substrate molecules, which are released as a linear tetrapyrrole product. Expression in Escherichia coli of a His-tagged form of B. megaterium PBGD has permitted the X-ray analysis of the enzyme from this species at high resolution, showing that the cofactor becomes progressively oxidized to the dipyrromethene and dipyrromethanone forms. In previously solved PBGD structures, the oxidized cofactor is in the dipyromethenone form, in which both pyrrole rings are approximately coplanar. In contrast, the oxidized cofactor in the B. megaterium enzyme appears to be in the dipyrromethanone form, in which the C atom at the bridging α-position of the outer pyrrole ring is very clearly in a tetrahedral configuration. It is suggested that the pink colour of the freshly purified protein is owing to the presence of the dipyrromethene form of the cofactor which, in the structure reported here, adopts the same conformation as the fully reduced dipyrromethane form

Distinction entre fumeurs occasionnels et réguliers de cannabis : le dosage du THCCOOH-glucuronide permet-il un meilleur diagnostic ?

Objectifs Le but de cette étude est de montrer que les concentrations de THCCOOH-glucuronide (gluc) dans le sang total peuvent être utilisées en complément des concentrations de THCCOOH libre pour permettre de distinguer les fumeurs réguliers des fumeurs occasionnels de cannabis. Méthodes Une étude d’administration contrôlée de cannabis contre placebo a été menée au CHU de Lausanne, Suisse [1]. Vingt-trois fumeurs réguliers (déclarant consommer plus de 10 fois/mois) et 25 fumeurs occasionnels (entre 1 fois/mois et 1 fois/semaine) de cannabis ont fumé un joint de cannabis ou un joint placebo selon un protocole minuté. Des échantillons de sang ont été prélevés avant et jusqu’à 5 h après l’inhalation. Les analyses de THCCOOH ont été effectuées par GC– ou LC-MS/MS dans les jours suivants, puis les échantillons ont été conservés à –80 °C. Trois à 6 ans plus tard, les échantillons ont été décongelés et analysés par LC-MS/MS pour le THCCOOH et le THCCOOH-gluc. L’analyse de courbes ROC [1] a ensuite été appliquée aux concentrations mesurées pour déterminer des cut-offs permettant de distinguer fumeurs réguliers et occasionnels. Résultats – Pour les fumeurs réguliers, les concentrations de THCCOOH libre mesurées en 2015 sont en moyenne supérieures de 1,7 μg/L (6,0 %) à celles mesurées précédemment. – Les concentrations en THCCOOH-gluc chez les fumeurs réguliers vont de 4,1 à 358 μg/L. À ce jour, 73 échantillons des fumeurs occasionnels ont été analysés, les valeurs vont de < 5 à 65,6 μg/L. – La concentration molaire maximale de THCCOOH total (libre + gluc) mesurée chez les fumeurs occasionnels est de 0,167 μmol/L, soit l’équivalent de 57 μg/L de THCCOOH. Chez les réguliers, les concentrations vont de 0,014 μmol/L (4,82 μg/L) à 1,095 μmol/L (377 μg/L). 4) Plusieurs seuils de concentrations permettant de distinguer les fumeurs réguliers des occasionnels avec 100 % de spécificité ont été mis en évidence : 66 μg/L de THCCOOH-gluc (sensibilité 27 %) et/ou 57 μg/L de THCCOOH total (sensibilité 52 %) contre 40 μg/L (sensibilité 20 %) si on considère uniquement le THCCOOH libre comme précédemment [1]. Conclusion La conservation des échantillons de sang à –80 °C permet une bonne stabilité des échantillons : les concentrations en THCCOOH de 2015 sont supérieures de 6 % en moyenne à celles des années précédentes, probablement à cause d’une dégradation partielle du gluc. Nos résultats suggèrent qu’une concentration en THCCOOH-gluc supérieure à 66 μg/L correspond à une consommation régulière de cannabis. De même, nous proposons une concentration seuil de 60 μg/L de THCCOOH total dans le sang complet pour mettre en évidence un usage régulier de cannabis. Ces valeurs sont à confirmer avec les analyses de l’ensemble des échantillons des fumeurs occasionnels

Distinction entre fumeurs occasionnels et réguliers de cannabis : le dosage du THCCOOHglucuronide permet-il un meilleur diagnostic ? (015)

Objectifs Le but de cette étude est de montrer que les concentrations de THCCOOH-glucuronide (gluc) dans le sang total peuvent être utilisées en complément des concentrations de THCCOOH libre pour permettre de distinguer les fumeurs réguliers des fumeurs occasionnels de cannabis. Méthodes Une étude d’administration contrôlée de cannabis contre placebo a été menée au CHU de Lausanne, Suisse [1]. Vingt-trois fumeurs réguliers (déclarant consommer plus de 10 fois/mois) et 25 fumeurs occasionnels (entre 1 fois/mois et 1 fois/semaine) de cannabis ont fumé un joint de cannabis ou un joint placebo selon un protocole minuté. Des échantillons de sang ont été prélevés avant et jusqu’à 5 h après l’inhalation. Les analyses de THCCOOH ont été effectuées par GC– ou LC-MS/MS dans les jours suivants, puis les échantillons ont été conservés à –80 °C. Trois à 6 ans plus tard, les échantillons ont été décongelés et analysés par LC-MS/MS pour le THCCOOH et le THCCOOH-gluc. L’analyse de courbes ROC [1] a ensuite été appliquée aux concentrations mesurées pour déterminer des cut-offs permettant de distinguer fumeurs réguliers et occasionnels. Résultats – Pour les fumeurs réguliers, les concentrations de THCCOOH libre mesurées en 2015 sont en moyenne supérieures de 1,7 μg/L (6,0 %) à celles mesurées précédemment. – Les concentrations en THCCOOH-gluc chez les fumeurs réguliers vont de 4,1 à 358 μg/L. À ce jour, 73 échantillons des fumeurs occasionnels ont été analysés, les valeurs vont de < 5 à 65,6 μg/L. – La concentration molaire maximale de THCCOOH total (libre + gluc) mesurée chez les fumeurs occasionnels est de 0,167 μmol/L, soit l’équivalent de 57 μg/L de THCCOOH. Chez les réguliers, les concentrations vont de 0,014 μmol/L (4,82 μg/L) à 1,095 μmol/L (377 μg/L). 4) Plusieurs seuils de concentrations permettant de distinguer les fumeurs réguliers des occasionnels avec 100 % de spécificité ont été mis en évidence : 66 μg/L de THCCOOH-gluc (sensibilité 27 %) et/ou 57 μg/L de THCCOOH total (sensibilité 52 %) contre 40 μg/L (sensibilité 20 %) si on considère uniquement le THCCOOH libre comme précédemment [1]. Conclusion La conservation des échantillons de sang à –80 °C permet une bonne stabilité des échantillons : les concentrations en THCCOOH de 2015 sont supérieures de 6 % en moyenne à celles des années précédentes, probablement à cause d’une dégradation partielle du gluc. Nos résultats suggèrent qu’une concentration en THCCOOH-gluc supérieure à 66 μg/L correspond à une consommation régulière de cannabis. De même, nous proposons une concentration seuil de 60 μg/L de THCCOOH total dans le sang complet pour mettre en évidence un usage régulier de cannabis. Ces valeurs sont à confirmer avec les analyses de l’ensemble des échantillons des fumeurs occasionnels

Accurate and highly complete synchrotron protein crystal Laue diffraction data using the ESRF CCD and the Daresbury Laue software

Developments in electronic area detectors such as CCDs and image plates have transformed the capability of the synchrotron Laue protein crystallography technique compared with film. The rapid readout of CCDs makes practical the use of rather fine angular interval settings of the crystal between each Laue exposure and a large overall angle coverage. The use of the ESRF CCD (image intensifier type) presented here in the Laue data collection on ESRF ID09 (the 'Laue beamline') from a single crystal of the 34 kDa wild-type hydroxymethylbilane synthase (HMBS), space group P2 12 12 a = 88.06, b = 75.73, c = 50.35 Å, yielded 47 Laue exposures in 2.5° angle intervals from a single crystal. The data processed by the Daresbury Laue software is highly complete (∞-2d min = 77.5%; 2d min-d min = 91.7%) to 2.3 Å with high redundancy (11.2). Comparison with calculated structure factors and careful analysis of the Laue geometry shows that between ∞ and 5d min better completeness still should be possible, which can ideally be realized from CCD detector dynamic range hardware improvements and/or software algorithms to integrate saturated spot profiles. Prospects for Laue diffraction data collection using yet faster detectors such as the 'pixel detector' to study irreversible catalytic structural processes in a crystal, the most challenging of all time-resolved experiments, are bright.link_to_subscribed_fulltex

Crystallization and preliminary X-ray characterization of the tetrapyrrole-biosynthetic enzyme porphobilinogen deaminase from Arabidopsis thaliana

The enzyme porphobilinogen deaminase (PBGD; hydroxymethylbilane synthase; EC 2.5.1.61) catalyses a key early step of the haem-biosynthesis pathway in which four molecules of the monopyrrole porphobilinogen are condensed to form a linear tetrapyrrole. The enzyme possesses a dipyrro- methane cofactor which is covalently linked by a thioether bridge to an invariant cysteine residue. Since PBGD catalyses a reaction which is common to the biosynthesis of both haem and chlorophyll, structural studies of a plant PBGD enzyme offer great potential for the discovery of novel herbicides. Until recently, structural data have only been available for the Escherichia coli and human forms of the enzyme. Expression in E. coli of a codon-optimized gene for Arabidopsis thaliana PBGD has permitted for the first time the crystallization and preliminary X-ray analysis of the enzyme from a plant species at high resolution