Quantification of biomolecular binding dynamics by Fluorescence Correlation Spectroscopy

Diffusion and molecular binding processes are indispensable for biological systems. A vital step towards the understanding of such dynamics and their interplay is a thorough quantification of all parameters involved. This work addresses the characterization of biomolecular diffusion and binding dynamics using fluorescence correlation spectroscopy (FCS). To quantify the reversible surface attachment of fluorescently labeled molecules, a novel method termed surface-integrated FCS (SI-FCS) is developed. Using this technique, the association and dissociation rates of receptor-ligand pairs can be determined over a wide range of time scales, ranging from hundreds of milliseconds to tens of seconds. The surface of interest is exposed to a widefield illumination and a highly sensitive electron-multiplying charge-coupled device (EMCCD) camera is used for detection, not only providing single-molecule sensitivity, but also enabling a parallel detection of the signal, which facilitates multiplexed SI-FCS measurements across the field of view. To validate this approach, we quantify the reversible hybridization of single-stranded deoxyribonucleic acid (DNA) using a standard total internal reflection fluorescence (TIRF) microscope. The nucleotide overlap was systematically varied to demonstrate the sensitivity of SI-FCS. Furthermore, this work extensively employs FCS in its more conventional form using a confocal microscope. The effect of refractive index mismatches on single-focus FCS measurements is thoroughly characterized and a regime in which unbiased experiments are possible is identified. Confocal FCS is used to monitor the filament formation of FtsZ proteins (filamenting temperature-sensitive mutant Z) and their breakage by the protein MipZ in vitro. Potential artifacts are identified and a novel model to analyze diffusing filaments in FCS experiments is derived, applied, and validated. These findings not only demonstrate that filament formation can be efficiently studied using confocal FCS, but also indicate that FtsZ from Caulobacter crescentus may intrinsically form small oligomers. Finally, this work characterizes the diffusion of biomolecules in lipid monolayers at the air-water interface using confocal FCS. A miniaturized fixed area-chamber, which requires only minute amounts of protein, is presented and validated. Using this design, monolayer experiments become accessible to studies where biomolecules can only be purified in small amounts. Moreover, the quantification of diffusion in monolayers using FCS is a major step towards the routine characterization of binding of biomolecules to lipid monolayers.Diffusion und molekulare Bindungsreaktionen sind elementare Prozesse in biologischen Systemen. Für das Verständnis solcher Dynamiken und deren Wechselwirkungen ist es letztlich unabdingbar die beteiligten Parameter exakt zu quantifizieren. Diesem Ziel folgend setzt sich diese Arbeit mit der Quantifizierung von Diffusions- und Bindungsdynamiken unter Nutzung der Fluoreszenzkorrelationsspektroskopie (FCS) auseinander. Um die Assoziations- und Dissoziationsraten von reversiblen Bindungsreaktionen an Oberflächen zu messen, wurde im Rahmen dieser Arbeit eine neuartige Methode namens "surface-integrated FCS" (SI-FCS) entwickelt. Mittels dieser Methode können Bindungsraten zwischen Rezeptoren und fluoreszierenden Liganden in Zeitbereichen von Millisekunden bis über einer Minute gemessen werden. Die zu untersuchende Oberfläche, an der die Bindungsreaktionen stattfinden, wird mit einer Weitfeldausleuchtung beschienen und die daraufhin emittierte Fluoreszenz von den Liganden wird mit einer sehr empfindlichen Kamera (electron-multiplying charge-coupled device) detektiert. Diese Flächendetektion verfügt nicht nur über ausreichende Empfindlichkeit um einzelne Moleküle zu detektieren, sondern ermöglicht auch die parallele Messung mehrerer Autokorrelationskurven im Sichtfeld. Zur Validierung dieses neuartigen Ansatzes wird die reversible Hybridisierung von Desoxyribonukleinsäuren (DNS) mit einem im Rahmen dieser Arbeit konstruierten totalreflexionsbasiertem Fluoreszenzmikroskop (TIRF Mikroskop) quantifiziert. Die Anzahl der hybridisierenden Basenpaare wird in dieser Studie systematisch variiert und drückt sich in klaren Änderungen der gemessenen Bindungsraten aus. Damit wird die Sensitivität der Methode unterstrichen. Darüber hinaus bedient sich diese Arbeit der konventionellen konfokalen FCS. Das Problem von Proben, die einen anderen Brechungsindex als den von Wasser aufweisen, wird intensiv im Kontext von FCS Messungen beleuchtet. Abschließend werden Messbedingungen aufgezeigt unter denen systematische Messfehler und Artefakte, die auf den Brechungsindex zurückzuführen sind, vermieden werden können. In einem Teil dieser Arbeit wird die konfokale FCS genutzt um die Polymerisation von FtsZ Proteinen (Filamenting Temperature-Sensitive Z), sowie deren Zerlegung durch das Protein MipZ, zu untersuchen. Potentielle Fehlerquellen solcher Messungen werden beleuchtet und ein neues Modell für die Analyse von konfokalen FCS Messungen an Filamenten wird hergeleitet. Die präsentierten Ergebnisse zeigen nicht nur, dass FCS eine geeignete Methode ist umWachstum und Zerfall von Filamenten im Allgemeinen zu charakterisieren, sondern liefern auch deutliche Hinweise, dass FtsZ aus dem Bakterium Caulobacter crescentus auch in Abwesenheit von Guanosintriphosphat (GTP) kurze Oligomere bildet. Letzteres ist insbesondere interessant, da typischerweise angenommen wird, dass FtsZ als monomeres Protein vorliegt und erst in Anwesenheit von GTP zu Filamenten polymerisiert. Abschließend quantifiziert diese Arbeit die Diffusion von Biomolekülen in Lipidmonoschichten an der Grenzfläche zwischen Luft und Wasser. Unter Verwendung der konfokalen FCS werden Messungen in Miniaturkammern durchgeführt und validiert. Mithilfe dieser Methode werden Messungen an Biomolekülen ermöglicht, die nur in sehr geringen Mengen aufgereinigt werden können. Die hier präsentierten Diffusionsmessungen stellen einen wichtigen Schritt hin zur FCS basierten Charakterisierung der Bindungskinetiken von Biomolekülen zu Lipidmonoschichten dar

Modular flats of oriented matroids and poset quasi-fibrations

We study the combinatorics of modular flats of oriented matroids and the topological consequences for their Salvetti complexes. We show that the natural map to the localized Salvetti complex at a modular flat of corank one is what we call a poset quasi-fibration -- a notion derived from Quillen's fundamental Theorem B from algebraic $K$-theory. As a direct consequence, the Salvetti complex of an oriented matroid whose geometric lattice is supersolvable is a $K(\pi,1)$-space -- a generalization of the classical result for supersolvable hyperplane arrangements due to Falk, Randell and Terao. Furthermore, the fundamental group of the Salvetti complex of a supersolvable oriented matroid is an iterated semidirect product of finitely generated free groups -- analogous to the realizable case. Our main tools are discrete Morse theory, the shellability of certain subcomplexes of the covector complex of an oriented matroid, a nice combinatorial decomposition of poset fibers of the localization map, and an isomorphism of covector posets associated to modular elements. We provide a simple construction of supersolvable oriented matroids. This gives many non-realizable supersolvable oriented matroids and by our main result aspherical CW-complexes.Comment: 27 paper, 7 figure

On Yuzvinsky's lattice sheaf cohomology for hyperplane arrangements

We establish the relationship between the cohomology of a certain sheaf on the intersection lattice of a hyperplane arrangement introduced by Yuzvinsky and the cohomology of the coherent sheaf on punctured affine space, respectively projective space associated to the module of logarithmic vector fields along the arrangement. Our main result gives a K\"unneth formula connecting the cohomology theories, answering a question by Yoshinaga. This, in turn, provides a characterization of the projective dimension of the module of logarithmic vector fields and yields a new proof of Yuzvinsky's freeness criterion. Furthermore, our approach affords a new formulation of Terao's freeness conjecture and a more general problem.Comment: 20 pages, v3 several small changes. Some parts of the introduction are rewritten with a new numbering of the main theorems. Also added a final section with concluding remark

Combinatorics and freeness of hyperplane arrangements and reflection arrangements

[no abstract

Quantification of biomolecular binding dynamics by Fluorescence Correlation Spectroscopy

Diffusion and molecular binding processes are indispensable for biological systems. A vital step towards the understanding of such dynamics and their interplay is a thorough quantification of all parameters involved. This work addresses the characterization of biomolecular diffusion and binding dynamics using fluorescence correlation spectroscopy (FCS). To quantify the reversible surface attachment of fluorescently labeled molecules, a novel method termed surface-integrated FCS (SI-FCS) is developed. Using this technique, the association and dissociation rates of receptor-ligand pairs can be determined over a wide range of time scales, ranging from hundreds of milliseconds to tens of seconds. The surface of interest is exposed to a widefield illumination and a highly sensitive electron-multiplying charge-coupled device (EMCCD) camera is used for detection, not only providing single-molecule sensitivity, but also enabling a parallel detection of the signal, which facilitates multiplexed SI-FCS measurements across the field of view. To validate this approach, we quantify the reversible hybridization of single-stranded deoxyribonucleic acid (DNA) using a standard total internal reflection fluorescence (TIRF) microscope. The nucleotide overlap was systematically varied to demonstrate the sensitivity of SI-FCS. Furthermore, this work extensively employs FCS in its more conventional form using a confocal microscope. The effect of refractive index mismatches on single-focus FCS measurements is thoroughly characterized and a regime in which unbiased experiments are possible is identified. Confocal FCS is used to monitor the filament formation of FtsZ proteins (filamenting temperature-sensitive mutant Z) and their breakage by the protein MipZ in vitro. Potential artifacts are identified and a novel model to analyze diffusing filaments in FCS experiments is derived, applied, and validated. These findings not only demonstrate that filament formation can be efficiently studied using confocal FCS, but also indicate that FtsZ from Caulobacter crescentus may intrinsically form small oligomers. Finally, this work characterizes the diffusion of biomolecules in lipid monolayers at the air-water interface using confocal FCS. A miniaturized fixed area-chamber, which requires only minute amounts of protein, is presented and validated. Using this design, monolayer experiments become accessible to studies where biomolecules can only be purified in small amounts. Moreover, the quantification of diffusion in monolayers using FCS is a major step towards the routine characterization of binding of biomolecules to lipid monolayers.Diffusion und molekulare Bindungsreaktionen sind elementare Prozesse in biologischen Systemen. Für das Verständnis solcher Dynamiken und deren Wechselwirkungen ist es letztlich unabdingbar die beteiligten Parameter exakt zu quantifizieren. Diesem Ziel folgend setzt sich diese Arbeit mit der Quantifizierung von Diffusions- und Bindungsdynamiken unter Nutzung der Fluoreszenzkorrelationsspektroskopie (FCS) auseinander. Um die Assoziations- und Dissoziationsraten von reversiblen Bindungsreaktionen an Oberflächen zu messen, wurde im Rahmen dieser Arbeit eine neuartige Methode namens "surface-integrated FCS" (SI-FCS) entwickelt. Mittels dieser Methode können Bindungsraten zwischen Rezeptoren und fluoreszierenden Liganden in Zeitbereichen von Millisekunden bis über einer Minute gemessen werden. Die zu untersuchende Oberfläche, an der die Bindungsreaktionen stattfinden, wird mit einer Weitfeldausleuchtung beschienen und die daraufhin emittierte Fluoreszenz von den Liganden wird mit einer sehr empfindlichen Kamera (electron-multiplying charge-coupled device) detektiert. Diese Flächendetektion verfügt nicht nur über ausreichende Empfindlichkeit um einzelne Moleküle zu detektieren, sondern ermöglicht auch die parallele Messung mehrerer Autokorrelationskurven im Sichtfeld. Zur Validierung dieses neuartigen Ansatzes wird die reversible Hybridisierung von Desoxyribonukleinsäuren (DNS) mit einem im Rahmen dieser Arbeit konstruierten totalreflexionsbasiertem Fluoreszenzmikroskop (TIRF Mikroskop) quantifiziert. Die Anzahl der hybridisierenden Basenpaare wird in dieser Studie systematisch variiert und drückt sich in klaren Änderungen der gemessenen Bindungsraten aus. Damit wird die Sensitivität der Methode unterstrichen. Darüber hinaus bedient sich diese Arbeit der konventionellen konfokalen FCS. Das Problem von Proben, die einen anderen Brechungsindex als den von Wasser aufweisen, wird intensiv im Kontext von FCS Messungen beleuchtet. Abschließend werden Messbedingungen aufgezeigt unter denen systematische Messfehler und Artefakte, die auf den Brechungsindex zurückzuführen sind, vermieden werden können. In einem Teil dieser Arbeit wird die konfokale FCS genutzt um die Polymerisation von FtsZ Proteinen (Filamenting Temperature-Sensitive Z), sowie deren Zerlegung durch das Protein MipZ, zu untersuchen. Potentielle Fehlerquellen solcher Messungen werden beleuchtet und ein neues Modell für die Analyse von konfokalen FCS Messungen an Filamenten wird hergeleitet. Die präsentierten Ergebnisse zeigen nicht nur, dass FCS eine geeignete Methode ist umWachstum und Zerfall von Filamenten im Allgemeinen zu charakterisieren, sondern liefern auch deutliche Hinweise, dass FtsZ aus dem Bakterium Caulobacter crescentus auch in Abwesenheit von Guanosintriphosphat (GTP) kurze Oligomere bildet. Letzteres ist insbesondere interessant, da typischerweise angenommen wird, dass FtsZ als monomeres Protein vorliegt und erst in Anwesenheit von GTP zu Filamenten polymerisiert. Abschließend quantifiziert diese Arbeit die Diffusion von Biomolekülen in Lipidmonoschichten an der Grenzfläche zwischen Luft und Wasser. Unter Verwendung der konfokalen FCS werden Messungen in Miniaturkammern durchgeführt und validiert. Mithilfe dieser Methode werden Messungen an Biomolekülen ermöglicht, die nur in sehr geringen Mengen aufgereinigt werden können. Die hier präsentierten Diffusionsmessungen stellen einen wichtigen Schritt hin zur FCS basierten Charakterisierung der Bindungskinetiken von Biomolekülen zu Lipidmonoschichten dar

MAT-free reflection arrangements

We introduce the class of MAT-free hyperplane arrangements which is based on the Multiple Addition Theorem by Abe, Barakat, Cuntz, Hoge, and Terao. We also investigate the closely related class of MAT2-free arrangements based on a recent generalization of the Multiple Addition Theorem by Abe and Terao. We give classifications of the irreducible complex reflection arrangements which are MAT-free respectively MAT2-free. Furthermore, we ask some questions concerning relations to other classes of free arrangements. © The authors

Toward Absolute Molecular Numbers in DNA-PAINT

Single-molecule localization microscopy (SMLM) has revolutionized optical microscopy, extending resolution down to the level of individual molecules. However, the actual counting of molecules relies on preliminary knowledge of the blinking behavior of individual targets or on a calibration to a reference. In particular for biological applications, great care has to be taken because a plethora of factors influence the quality and applicability of calibration-dependent approaches to count targets in localization clusters particularly in SMLM data obtained from heterogeneous samples. Here, we present localization-based fluorescence correlation spectroscopy (lbFCS) as the first absolute molecular counting approach for DNA-points accumulation for imaging in nanoscale topography (PAINT) microscopy and, to our knowledge, for SMLM in general. We demonstrate that lbFCS overcomes the limitation of previous DNA-PAINT counting and allows the quantification of target molecules independent of the localization cluster density. In accordance with the promising results of our systematic proof-of-principle study on DNA origami structures as idealized targets, lbFCS could potentially also provide quantitative access to more challenging biological targets featuring heterogeneous cluster sizes in the future

Photo-Induced Depletion of Binding Sites in DNA-PAINT Microscopy

The limited photon budget of fluorescent dyes is the main limitation for localization precision in localization-based super-resolution microscopy. Points accumulation for imaging in nanoscale topography (PAINT)-based techniques use the reversible binding of fluorophores and can sample a single binding site multiple times, thus elegantly circumventing the photon budget limitation. With DNA-based PAINT (DNA-PAINT), resolutions down to a few nanometers have been reached on DNA-origami nanostructures. However, for long acquisition times, we find a photo-induced depletion of binding sites in DNA-PAINT microscopy that ultimately limits the quality of the rendered images. Here we systematically investigate the loss of binding sites in DNA-PAINT imaging and support the observations with measurements of DNA hybridization kinetics via surface-integrated fluorescence correlation spectroscopy (SI-FCS). We do not only show that the depletion of binding sites is clearly photo-induced, but also provide evidence that it is mainly caused by dye-induced generation of reactive oxygen species (ROS). We evaluate two possible strategies to reduce the depletion of binding sites: By addition of oxygen scavenging reagents, and by the positioning of the fluorescent dye at a larger distance from the binding site