Study of methylation biomarkers in ovarian cancer

Ovarian cancer is the fourth most common gynecological malignancy and the fifth leading cause of cancer-related mortality in women. It is characterized by a remarkable histological and molecular heterogeneity, with the main subtype being high grade serous ovarian carcinoma (HGSC). This doctoral thesis is focused on DNA methylation of selected genes in clinical samples of patients with HGSC. For all methylation studies, we recruited FFPE samples of primary tumors, adjacent morphologically normal tissues, as well as corresponding plasma samples from the same patients. For the evaluation of methylation, we used two different methodologies, a real-time methylation specific PCR (real-time MSP) for the detection of methylation in tumor and adjacent FFPEs, as well as plasma circulating tumor DNA (ctDNA), and a methylation-sensitive high-resolution melting analysis (MS-HRMA) for the semi-quantitative estimation of methylation in tumor and adjacent FFPEs.At first, in a comparison study, we investigated RASSF1A promoter methylation status in primary tumors, adjacent morphologically normal tissues and corresponding plasma samples of patients with HGSC. In primary tumors and adjacent tissues, RASSF1A promoter methylation was significantly correlated with worse patients’ overall survival (OS). In this study, we reported for the first time that RASSF1A promoter methylation provides significant prognostic information in HGSC patients.We next examined ESR1 methylation in primary tumors and ctDNA of patients with HGSC. In primary tumors, ESR1 methylation was significantly correlated with better patients’ OS and progression free survival (PFS). In this study, we attempted to clarify the role of ESR1 methylation in HGSC.We next performed methylation studies of specific genes involved in molecular pathways which are frequently disrupted in HGSC, such as BRCA1 and MGMT genes involved in different ways in DNA repair, the NR2F1 gene that is actively involved in the establishment of a dormant phenotype, the RASSF10 gene involved in the development of chemoresistance and the RKIP gene involved in the EMT process. After the statistical analysis of the results, we observed a significant correlation between NR2F1 methylation in primary tumors with worse patients’ PFS. Furthermore, BRCA1 methylation in ctDNA was significantly correlated with better PFS. Finally, we estimated PD-L1 gene expression in circulating tumor cells (CTCs) of patients with HGSC, using RT-qPCR. Based on the results of the study, a statistically significant association between PD-L1 gene expression and worse patients’ OS was observed, indicating a possible prognostic significance in HGSC.Ο καρκίνος των ωοθηκών αποτελεί τον τέταρτο συχνότερα εμφανιζόμενο γυναικολογικό καρκίνο και την πέμπτη αιτία θανάτου σχετιζόμενη με καρκίνο στις γυναίκες. Χαρακτηρίζεται από αξιοσημείωτη ιστολογική και μοριακή ετερογένεια, με κυριότερο υπότυπο τον ορώδη καρκίνο ωοθηκών υψηλού βαθμού κακοήθειας (high grade serous ovarian carcinoma, HGSC), που μελετήθηκε στη διατριβή. Η παρούσα διατριβή έχει σκοπό τη μελέτη της μεθυλίωσης επιλεγμένων γονιδίων στον ορώδη καρκίνο ωοθηκών υψηλού βαθμού κακοήθειας. Τα κλινικά δείγματα που χρησιμοποιήθηκαν είναι δείγματα πρωτοπαθών όγκων, αντίστοιχα δείγματα παρακείμενων ιστών, καθώς και αντίστοιχα δείγματα κυκλοφορούντος καρκινικού DNA (circulating tumor DNA, ctDNA) από τις ίδιες ασθενείς. Οι μεθοδολογίες που εφαρμόστηκαν συνιστούν την real-time MSP για την ανίχνευση της μεθυλίωσης σε δείγματα πρωτοπαθών όγκων, παρακείμενων ιστών και πλάσματος, καθώς και την MS-HRMA για τον ημιποσοτικό προσδιορισμό της μεθυλίωσης σε δείγματα πρωτοπαθών όγκων και παρακείμενων ιστών. Αρχικά εξετάστηκε η μεθυλίωση του ογκοκατασταλτικού γονιδίου RASSF1A, όπου πραγματοποιήθηκε μία συγκριτική μελέτη σε δείγματα πρωτοπαθών όγκων, παρακείμενων ιστών και ctDNA ασθενών με HGSC. Η μεθυλίωση του γονιδίου στα δείγματα πρωτοπαθών όγκων και παρακείμενων ιστών συσχετίστηκε με σημαντικά μειωμένη ολική επιβίωση (overall survival, OS) των ασθενών. Τα συνολικά αποτελέσματα της μελέτης υπέδειξαν για πρώτη φορά την προγνωστική σημασία της μεθυλίωσης του γονιδίου στον HGSC. Στη συνέχεια, ακολούθησε μελέτη μεθυλίωσης του γονιδίου ESR1, όπου πραγματοποιήθηκε μελέτη σε δείγματα πρωτοπαθών όγκων και ctDNA ασθενών με HGSC. Η μεθυλίωση του γονιδίου στα δείγματα πρωτοπαθών όγκων συσχετίστηκε με σημαντικά αυξημένα OS και διάστημα επιβίωσης χωρίς εξέλιξη της νόσου (progression free survival, PFS) των ασθενών. H παρούσα μελέτη αποτέλεσε μία προσπάθεια αποσαφήνισης του ρόλου της μεθυλίωσης του γονιδίου στον HGSC. Ακολούθησαν οι μελέτες μεθυλίωσης γονιδίων που εμπλέκονται σε μοριακά μονοπάτια που διαταράσσονται στον HGSC, όπως τα γονίδια BRCA1 και MGMT που συμμετέχουν σε διαφορετικές πορείες επιδιόρθωσης του DNA, το γονίδιο NR2F1 που συμμετέχει ενεργά στην κυτταρική αδράνεια, τα γονίδιο RASSF10 που εμπλέκεται στην ανάπτυξη χημειοαντίστασης, καθώς και το γονίδιο RKIP που συμμετέχει στην ΕΜΤ διαδικασία. Ύστερα από τη συνολική επεξεργασία των αποτελεσμάτων, παρατηρήθηκε στατιστικά σημαντική συσχέτιση της μεθυλίωσης του γονιδίου NR2F1 στα δείγματα πρωτοπαθών όγκων, με μειωμένο PFS. Επιπλέον, η μεθυλίωση του γονιδίου BRCA1 στο ctDNA συσχετίστηκε με σημαντικά αυξημένο PFS. Τέλος, πραγματοποιήθηκε μελέτη της έκφρασης του γονιδίου PD-L1 σε δείγματα κυκλοφορούντων καρκινικών κυττάρων (circulating tumor cells, CTCs) ασθενών με HGSC, με την εφαρμογή RT-qPCR. Με βάση τα αποτελέσματα της μελέτης, παρατηρήθηκε στατιστικά σημαντική συσχέτιση της έκφρασης του γονιδίου με μειωμένη OS των ασθενών, υποδεικνύοντας μία πιθανή προγνωστική σημασία στον HGSC

Μελέτη δεικτών μεθυλίωσης στον καρκίνο των ωοθηκών

Ο καρκίνος των ωοθηκών αποτελεί τον τέταρτο συχνότερα εμφανιζόμενο γυναικολογικό καρκίνο και την πέμπτη αιτία θανάτου σχετιζόμενη με καρκίνο στις γυναίκες. Χαρακτηρίζεται από αξιοσημείωτη ιστολογική και μοριακή ετερογένεια, με κυριότερο υπότυπο τον ορώδη καρκίνο ωοθηκών υψηλού βαθμού κακοήθειας (high grade serous ovarian carcinoma, HGSC), που μελετήθηκε στη διατριβή. Η παρούσα διατριβή έχει σκοπό τη μελέτη της μεθυλίωσης επιλεγμένων γονιδίων στον ορώδη καρκίνο ωοθηκών υψηλού βαθμού κακοήθειας. Τα κλινικά δείγματα που χρησιμοποιήθηκαν είναι δείγματα πρωτοπαθών όγκων, αντίστοιχα δείγματα παρακείμενων ιστών, καθώς και αντίστοιχα δείγματα κυκλοφορούντος καρκινικού DNA (circulating tumor DNA, ctDNA) από τις ίδιες ασθενείς. Οι μεθοδολογίες που εφαρμόστηκαν συνιστούν την real-time MSP για την ανίχνευση της μεθυλίωσης σε δείγματα πρωτοπαθών όγκων, παρακείμενων ιστών και πλάσματος, καθώς και την MS-HRMA για τον ημιποσοτικό προσδιορισμό της μεθυλίωσης σε δείγματα πρωτοπαθών όγκων και παρακείμενων ιστών. Αρχικά εξετάστηκε η μεθυλίωση του ογκοκατασταλτικού γονιδίου RASSF1A, όπου πραγματοποιήθηκε μία συγκριτική μελέτη σε δείγματα πρωτοπαθών όγκων, παρακείμενων ιστών και ctDNA ασθενών με HGSC. Η μεθυλίωση του γονιδίου στα δείγματα πρωτοπαθών όγκων και παρακείμενων ιστών συσχετίστηκε με σημαντικά μειωμένη ολική επιβίωση (overall survival, OS) των ασθενών. Τα συνολικά αποτελέσματα της μελέτης υπέδειξαν για πρώτη φορά την προγνωστική σημασία της μεθυλίωσης του γονιδίου στον HGSC. Στη συνέχεια, ακολούθησε μελέτη μεθυλίωσης του γονιδίου ESR1, όπου πραγματοποιήθηκε μελέτη σε δείγματα πρωτοπαθών όγκων και ctDNA ασθενών με HGSC. Η μεθυλίωση του γονιδίου στα δείγματα πρωτοπαθών όγκων συσχετίστηκε με σημαντικά αυξημένα OS και διάστημα επιβίωσης χωρίς εξέλιξη της νόσου (progression free survival, PFS) των ασθενών. H παρούσα μελέτη αποτέλεσε μία προσπάθεια αποσαφήνισης του ρόλου της μεθυλίωσης του γονιδίου στον HGSC. Ακολούθησαν οι μελέτες μεθυλίωσης γονιδίων που εμπλέκονται σε μοριακά μονοπάτια που διαταράσσονται στον HGSC, όπως τα γονίδια BRCA1 και MGMT που συμμετέχουν σε διαφορετικές πορείες επιδιόρθωσης του DNA, το γονίδιο NR2F1 που συμμετέχει ενεργά στην κυτταρική αδράνεια, τα γονίδιο RASSF10 που εμπλέκεται στην ανάπτυξη χημειοαντίστασης, καθώς και το γονίδιο RKIP που συμμετέχει στην ΕΜΤ διαδικασία. Ύστερα από τη συνολική επεξεργασία των αποτελεσμάτων, παρατηρήθηκε στατιστικά σημαντική συσχέτιση της μεθυλίωσης του γονιδίου NR2F1 στα δείγματα πρωτοπαθών όγκων, με μειωμένο PFS. Επιπλέον, η μεθυλίωση του γονιδίου BRCA1 στο ctDNA συσχετίστηκε με σημαντικά αυξημένο PFS. Τέλος, πραγματοποιήθηκε μελέτη της έκφρασης του γονιδίου PD-L1 σε δείγματα κυκλοφορούντων καρκινικών κυττάρων (circulating tumor cells, CTCs) ασθενών με HGSC, με την εφαρμογή RT-qPCR. Με βάση τα αποτελέσματα της μελέτης, παρατηρήθηκε στατιστικά σημαντική συσχέτιση της έκφρασης του γονιδίου με μειωμένη OS των ασθενών, υποδεικνύοντας μία πιθανή προγνωστική σημασία στον HGSC.Ovarian cancer is the fourth most common gynecological malignancy and the fifth leading cause of cancer-related mortality in women. It is characterized by a remarkable histological and molecular heterogeneity, with the main subtype being high grade serous ovarian carcinoma (HGSC). This doctoral thesis is focused on DNA methylation of selected genes in clinical samples of patients with HGSC. For all methylation studies, we recruited FFPE samples of primary tumors, adjacent morphologically normal tissues, as well as corresponding plasma samples from the same patients. For the evaluation of methylation, we used two different methodologies, a real-time methylation specific PCR (real-time MSP) for the detection of methylation in tumor and adjacent FFPEs, as well as plasma circulating tumor DNA (ctDNA), and a methylation-sensitive high-resolution melting analysis (MS-HRMA) for the semi-quantitative estimation of methylation in tumor and adjacent FFPEs. At first, in a comparison study, we investigated RASSF1A promoter methylation status in primary tumors, adjacent morphologically normal tissues and corresponding plasma samples of patients with HGSC. In primary tumors and adjacent tissues, RASSF1A promoter methylation was significantly correlated with worse patients’ overall survival (OS). In this study, we reported for the first time that RASSF1A promoter methylation provides significant prognostic information in HGSC patients. We next examined ESR1 methylation in primary tumors and ctDNA of patients with HGSC. In primary tumors, ESR1 methylation was significantly correlated with better patients’ OS and progression free survival (PFS). In this study, we attempted to clarify the role of ESR1 methylation in HGSC. We next performed methylation studies of specific genes involved in molecular pathways which are frequently disrupted in HGSC, such as BRCA1 and MGMT genes involved in different ways in DNA repair, the NR2F1 gene that is actively involved in the establishment of a dormant phenotype, the RASSF10 gene involved in the development of chemoresistance and the RKIP gene involved in the EMT process. After the statistical analysis of the results, we observed a significant correlation between NR2F1 methylation in primary tumors with worse patients’ PFS. Furthermore, BRCA1 methylation in ctDNA was significantly correlated with better PFS. Finally, we estimated PD-L1 gene expression in circulating tumor cells (CTCs) of patients with HGSC, using RT-qPCR. Based on the results of the study, a statistically significant association between PD-L1 gene expression and worse patients’ OS was observed, indicating a possible prognostic significance in HGSC

C-erb-B-2 oncoprotein and epidermal growth factor receptor in human hepatocellular carcinoma: An immunohistochemical study

The aim of this study was to evaluate the irnmunohistochemical expression of epidermal growth factor (EGFR) and c-erb-B-2 oncoprotein in a series of 71 hepatocellular carcinomas as well as in the adjacent hepatic tissue and to assess any correlation with HBsAg expression. The total of the 71 hepatocellular carcinomas (HCCs) was classified into 17 low grade and 54 high grade cases with adjacent non-neoplastic liver parenchyma, observed in 14 and 28 cases respectively. Coexisting cirrhosis or fibrosis was noticed in the adjacent non-neoplastic parenchyma in 12 cases of low grade and 22 cases of high grade HCC. The immunohistochemical avidin-biotin-peroxidase complex (ABC) method was performed on formalin-fixed paraffin sections for the detection of EGFR, c-erb-B-2 oncoprotein and HBsAg using monoclonal antibodies. The expression of c-erb-B-2 was observed in 29.5% (21171) of the HCCs showing no statistically significant correlation with histological grade. The c-erb-B-2 was also detected in the adjacent non-neoplastic parenchyma in 7/14 low grade HCCs, and in 9/28 high grade HCCs. No statistically significant differences in c-erb-B-2 oncoprotein expression were observed between the HCCs and the adjacent non-neoplastic parenchyma. In addition, HBsAg was detected in 10142 examined cases of HCC with adjacent non-neoplastic parenchyma, while only 4 cases of HCCs were simultaneously positive for c-erb-B-2 and HBsAg. EGFR was detected in only 3171 cases of HCC, while the antigen was not detected at al1 in the adjacent non neoplastic parenchyma. HBsAg expression was not observed in any of the EGFR-positive HCCs. Our results suggest that both c-erb-B-2-oncoprotein and EGFR do not seem to be predorninantly involved in the transformation of hepatocytes to the malignant phenotype

Lymphatic and blood vessel morphometry in invasive breast carcinomas: Relation with proliferation and VEGF-C and -D proteins expression

Introduction: The aim of the present study was to investigate the distribution of both lymphatics and blood microvessels in invasive breast carcinomas and the clinicopathological and prognostic significance of their density and size related parameters as well as their correlation with the proliferative potential of the tumor and VEGF-C and -D expression. Methods: Both single and double immunohistochemistry were applied on a series of 146 paraffin-embedded breast tissue specimens to detect VEGF-C and -D as well as lymphatics and blood microvessels, respectively. Computer-assisted morphometry was performed to evaluate the blood and lymphatic vessel density (BVD and LVD respectively) as well as various vascular size related parameters. Results: Lymphatics were detected within the stroma at the tumor border, while blood vessels were located in both the interior of the tumor mass and peritumor stroma. BV major axis, minor axis and perimeter inversely correlated with ER (p=0.011, p=0.023 and p=0.008 respectively), while LV major axis, minor axis and the perimeter inversely correlated with tumor nuclear grade (p=0.045, p=0.037 and p=0.032 respectively) and topoisomerase IIa (p=0.015, p=0.024 and p=0.045 respectively). The same LV parameters were found to positively correlate with cancerous VEGF-C (p<0.0001, p=0.092 and p=0.012 respectively) and VEGF-D in the stromal fibroblasts surrounding neoplastic cells (p=0.011, p=0.041 and p=0.026 respectively). High BVD exerted an unfavorable impact on both disease-free (p=0.021) and overall survival (p=0.031) of the patients. High LVD correlated with poor disease-free and overall survival only in the subgroup of patients with ER-negative tumors (p=0.056 and p=0.0312 respectively). Conclusion: These findings, for the first time, correlate lymphatic size with tumors of limited proliferative potential and higher nuclear differentiation. Moreover, they suggest that VEGF-C and -D expression influence lymphatic size rather than being involved in the increase of lymphatic vessel number

Cyclin D1 in invasive breast carcinoma: favourable prognostic significance in unselected patients and within subgroups with an aggressive phenotype

Aims: To study the clinicopathological and prognostic value of cyclin D1 overexpression in patients with breast carcinoma. Methods and results: Immunohistochemistry was performed on paraffin-embedded tissue specimens from 290 invasive breast carcinomas to detect the proteins cyclin D1, oestrogen receptor (ER), progesterone receptor (PR), p53, c-erbB2, and topoisomerase IIa (topoIIa). Cyclin D1 staining was quantified using a computerized image analysis method. Cyclin D1 overexpression characterized smaller, ER-positive and PR-positive tumours (P = 0.017, P &lt; 0.0001, and P &lt; 0.0001, respectively), of a lower histological and nuclear grade (P = 0.011 and P &lt; 0.0001, respectively), and with reduced expression of topoIIa (P = 0.001) and p53 (P &lt; 0.001). Cyclin D1 was found to have an independent favourable impact on the overall survival of both the unselected cohort of patients (P = 0.011) and of patients with ER-negative and lymph node-positive tumours (P = 0.034 and P = 0.015, respectively). In triple-negative tumours, cyclin D1 overexpression was found to have independent favourable impacts on both overall and relapse-free survival (P = 0.002 for both). Conclusions: This is the first immunohistochemical study to dissociate the advantageous prognostic effect of cyclin D1 overexpression from its association with ER expression, and to provide evidence that cyclin D1 overexpression may be a marker of prolonged survival in patient subgroups with aggressive phenotypes

The prognostic value of vascular endothelial growth factors (VEGFs)-A and -B and their receptor, VEGFR-1, in invasive breast carcinoma

Objectives. Vascular endothelial growth factors A and B (VEGF-A and VEGF-B) play a major role in angiogenesis and activate VEGF receptor I (VEGFR-1). However, the clinicopathologic and clinical value of VEGF-B and VEGFR-I in invasive breast carcinoma remains unclear. Methods. We immunohistochemically examined the expression pattern of VEGF-A, VEGF-B and VEGFR-1 in 177 invasive breast carcinomas in relation to clinicopathological parameters, p53, c-erbB2 proteins expression and patients’ survival. Results. VEGF-A, VEGF-B and VEGFR-1 were immunodetected predominantly in the cytoplasm of the malignant cells. None of the studied markers correlated with any of the clinicopathological parameters, other than stromal VEGFR-1 which inversely correlated with PR (p=0.021). Cancerous VEGF-A and stromal VEGFR-1 were positively related to p53 (p=0.016 and p=0.033, respectively). Cancerous VEGF-B was positively associated with c-erbB-2 (p=0.045) and was found to exert an unfavorable impact on both disease-free and the overall survival of the node-positive patients (p=0.05 and p=0.029, respectively). Cancerous VEGFR-1 was recognized as being an independent poor prognostic indicator (p=0.037). Conclusion. These findings suggest that, while VEGF-B seems to be useful as a prognostic indicator only in node-positive patients, VEGFR-1 may be an independent poor prognosticator in patients with invasive breast carcinoma. (c) 2006 Elsevier Inc. All rights reserved

Detection of ESR1 Mutations in Primary Tumors and Plasma Cell-Free DNA in High-Grade Serous Ovarian Carcinoma Patients

ESR1 mutations have been recently associated with resistance to endocrine therapy in metastatic breast cancer and their detection has led to the development and current evaluation of novel, highly promising therapeutic strategies. In ovarian cancer there have been just a few reports on the presence of ESR1 mutations. The aim of our study was to evaluate the frequency and the clinical relevance of ESR1 mutations in high-grade serous ovarian cancer (HGSOC). Drop-off droplet digital PCR (ddPCR) was first used to screen for ESR1 mutations in 60 primary tumors (FFPEs) from HGSOC patients and in 80 plasma cell-free DNA (cfDNA) samples from advanced and metastatic ovarian cancer patients. We further used our recently developed ESR1-NAPA assay to identify individual ESR1 mutations in drop-off ddPCR-positive samples. We report for the first time the presence of ESR1 mutations in 15% of FFPEs and in 13.8% of plasma cfDNA samples from advanced and metastatic ovarian cancer patients. To define the clinical significance of this finding, our results should be further validated in a large and well-defined cohort of ovarian cancer patients