Clonagem do cDNA e sequenciamento parcial do gene que codifica a enzima glutamato desidrogenase hepática de ovino

The mitochondrial enzyme Glutamate Dehydrogenase (GDH: EC 1.4.1.2) catalyzes the reversible deamination of the L-glutamate for 2-oxoglutarate (α-ketoglutarate) using NAD+ and NADP+ as coenzymes. It is one of the most important liver enzymes found in hepatocytes of cattle, sheep and goats. Infections by Fasciola spp., severe acute intoxication by toxins of plants such as Xanthium spp. and Senecio spp. as well as intoxication by copper result in the release of this enzyme in blood. The increase of the GDH indicates damage or hepatic necrosis in cattle and sheep. This is an enzyme of choice to evaluate the function of the ruminants. In the present study the cDNA, that codifies the GDH enzyme of the hepatocyte of sheep, was synthesized by means of RT-PCR making use of mRNA extracted from the liver of sheep. Part of the region where the cDNA of the GDH of the ovine is codified was amplified by PCR from primers synthesized through the comparison of the aligned sequences of Ovis aries, Bos taurus, Homo sapiens, Rattus norvegicus and Mus musculus available in the database. The cDNA was cloned in the vector pGEM®-T Easy (Promega) and inserted in Escherichia coli DH10B calcium competent cells by heat shock procedure. The plasmid DNA was purifi ed and after sequencing, the presence of 1292 pb was confirmed. The alignment of the sequence deduced of amino acid with other species revealed high homology among the GDHs.A enzima mitocondrial glutamato desidrogenase (GDH: EC 1.4.1.2) catalisa a desaminação reversível do L-glutamato para 2-oxoglutarato (α-cetoglutarato) usando o NAD+ e NADP+ como coenzimas. É uma das mais importantes enzimas hepáticas encontradas em hepatócitos de bovinos, ovinos e caprinos. Infecções por Fasciola spp., intoxicação grave aguda por toxinas de plantas, tais como Xanthium spp. e Senecio spp. e intoxicação por cobre resultam na liberação dessa enzima no sangue. O aumento da GDH indica danos ou necrose hepática em bovinos e ovinos. Esta é a enzima de escolha para avaliar a função hepática dos ruminantes. No presente trabalho o cDNA que codifica a enzima GDH do hepatócito de ovino foi sintetizado por meio de RT-PCR utilizando mRNA extraído do fígado de ovino. Parte da região de codificação do cDNA da GDH de ovino foi amplificada por PCR usando oligonucleotídeos iniciadores sintetizados a partir do alinhamento de sequências de ORFs de Ovis aries, Bos taurus, Homo sapiens, Rattus norvegicus e Mus musculus disponíveis em banco de dados. O cDNA foi clonado no vetor pGEM®-T Easy (Promega) e inserido em células cálcio-competentes de Escherichia coli DH10B através de choque térmico. O DNA plasmidial foi purificado e após o sequenciamento a presença de um inserto de 1292 pb foi confirmado. O alinhamento da sequência deduzida de aminoácidos com outras espécies revelou alta homologia entre as GDH

β-D-galactofuranosidase: Purification of the Penicillium fellutanum enzyme and its detection in Trypanosoma cruzi

A β-D-galactofuranose é um componente de várias macromoléculas de muitos organismos, incluindo bactérias, protozoários e fungos. Interessantemente este carboidrato não usual está ausente de glicoconjugados de mamíferos. Um método alternativo foi utilizado para purificar a β-D-galactofuranosidase utilizando p-nitrofenil-β-D-galactofuranosideo como substrato. O meio de cultura concentrado do fungo Penicillium fellutanum foi cromatografado em coluna de DEAE-Sepharose CL 6B, seguido de cromatografia em coluna de afinidade de 4-aminofenil-1-tio-β-D-galactofuranosideo-Sepharose, que permitiu a separação de dois picos com atividade enzimática após a eluição com D-galactônico-γ-lactona em um gradiente de 100 a 500 mM de NaCl. Os dois picos resultaram, quando analisados por SDS-PAGE, em um polipeptídeo de 70 kDa. Anticorpos produzidos contra a mistura das bandas recortadas do gel são capazes de imunoprecipitar 77 % das unidades totais de enzima. Uma das bandas recortadas foi submetida a microseqüenciamento, obtendo-se seqüências para 3 peptídeos (65, 73, 101). Anticorpos foram produzidos contra os peptídeos sintéticos e usados para imunoprecipitar um polipeptídeo com atividade de β-D-galactofuranosidase. Para verificar a presença de β-D-galactofuranosidase em T. cruzi, usamos a mesma coluna de afinidade de 4-aminofenil-1-tio-β-D-galactofuranosideo-Sepharose. Um extrato de formas epimastigotas marcadas metabolicamente com 35S-metionina foi aplicado na coluna de afinidade. A enzima foi eluída após a lavagem com D-galactônico-γ-lactona em um gradiente de NaCl 100 a 500 mM. A análise por SDS-PAGE do material eluido mostrou um polipeptídeo de massa molecular aparente 50-60 kDa que é reconhecido por anticorpos anti-β-D-galactofuranosidase. Os anticorpos reagem por imunoflorescência indireta também com parasitas fixados com paraformaldeído. O polipeptídio de 50-60 kDa foi empregado em ensaios de atividade enzimática. Praticamente nenhuma atividade foi detectada utilizando-se p-nitrofenil-β-D-galactofuranosideo como substrato. A LPPG (lipopeptideofosfoglicana), um glicoconjugado isolado de epimastigotas de T. cruzi foi empregada como substrato. A galactopiranose, produto da hidrólise da atividade enzimática, foi detectada por cromatografia de troca iônica em alto pH sugerindo a presença de β-D-galactofuranosidase em T.cruzi.β-D-galactofuranose is a component of several galactofuranose containing macromolecules of many organisms, including bacteria, protozoa and fungi. Interestingly, this unusual sugar is absent in mammalian glycoconjugates. An alternative and fast method for the purification of β-D-galactofuranosidase was developed using p-nitrophenyl-β-D-galactofuranoside as substrate. A concentrated culture medium from Penicillium fellutanum was chromatographed on DEAE-Sepharose CL 6B followed by an affinity chromatography column of 4-aminophenyl-1-thio-β-D-galactofuranoside-Sepharose which yielded two separate peaks of enzyme activity when elution was performed with 10mM D-galactonic acid-γ-lactone in a 100-500 mM NaCl gradient. Both peaks rendered a single 70 kDa protein as detected by SDS-PAGE. Antibodies elicited against a mixture of the single bands excised from the gel were capable to immunoprecipitate 77 % units out of total units of the enzyme from the crude extract. One of the excised bands was submited to microsequencing and the sequence for 3 peptides (65, 73, 101) was obtained. Antibodies were raised against the corresponding synthetic peptides and used to immunoprecipitade a polypeptide with β-D-galactofuranosidase activity. To verify the presence of β-D-galactofuranosidase in T. cruzi we used the same 4-aminophenyl-1-thio-β-D-galactofuranoside-Sepharose affinity column. An extract of epimastigotes metabolically labelled with 35S-methionine was applied on the affinity colunm. After washing, the putative enzyme was eluted by 10 mM D-galactonic acidy-γ-lactone and 100-500 mM NaCl gradient. SDS-PAGE analysis of the eluted material show a polypeptide with an apparent molecular mass of 50-60 kDa that is recognized by all the antibodies raised against β-D-galactofuranosidase from P. fellutanum. Also the antibodies react with p-formaldehyde fixed parasites as detected by indirect immunofluorescence. The 50-60 kDa polypeptide was then employed in enzymatic assays. Almost no enzymatic activity was observed when p-nitrophenyl galactofuranoside was employed as substrate. LPPG (lipopeptidophosphoglycan), a galactofuranose-con taining glycoconjugate isolated from epimastigotes of T. cruzi was then employed as substrate. Galactopyranose, the product of the enzymatic activity, was detected by high pH anion-exchange chromatography, suggesting the presence of β-D-galactofuranosidase in T. cruzi

Detection of alfa-L-fucosidase from Trypanosoma cruzi

Glicoconjugados são abundantes na superfície de Trypanosoma cruzi e têm sido bastante estudados por diferentes grupos. A degradação dessas moléculas, no entanto, tem sido alvo de pouco interesse. O objetivo deste trabalho foi determinar a atividade de alfa-L-fucosidase em T.cruzi uma vez que trabalhos anteriores haviam concluído que várias hidrolases, entre elas a alfa-L-fucosidase estavam ausentes em epimastigota (AVILA, et al., 1979). Empregando-se p-nitrofenilfucopiranosídeo como substrato e extrato de formas epimastigotas, verificou-se que a enzima apresenta praticamente a mesma atividade em um intervalo de pH entre 6,0 e 7,5, caindo drasticamente em pHs mais ácidos. A incubação prévia da enzima a 28°C em pH 7,0 leva à perda de aproximadamente 30% de sua atividade após 1h 30mim e à perda de 100% após 4 horas de incubação. O efeito de íons na atividade da enzima foi estudado,verificando-se que Zn +2 inibe 90% sua atividade, enquanto que outros, como o Ca +2 praticamente não tem efeito. A enzima é parcialmente encontrada na fração particulada, podendo ser solubilizada parcialmente com 1% de Triton X-100 ou com NaCl 1 M. As tentativas feitas de purificar a enzima foram infrutíferas, uma vez que não se encontraram condições para manter a proteína ativa por longos períodos de tempo. A alfa-L-fucosidase está presente não só em pimastigotas, mas também em tripomastigotas, embora parentemente com diferentes atividades específicas, sendo maior em epimastigotas. Mesmo nos epimastigotas, grandes variações de atividade específica foram detectadas ao longo deste trabalho (de 0,03 a 0,23 unidades). Anticorpos preparados contra alfa-L-fucosidase comercial de epidídimo bovino imunoprecipitaram de extratos de epimastigotas previamente marcados com 35 S-metionina, um polipeptídeo em torno de 50 kDa após eletroforese em gel desnaturante e uma banda de 130-150 kDa em gel não desnaturante, sugerindo que a enzima em T.cruzi pode ser dimérica, a exemplo de outras alfa-L-fucosidases descritas na literatura. A imunoprecipitação de extrato de epimastigotas marcados com 35 S-metionina na presença de tunicamicina, com o anticorpo anti-alfa-L-fucosidase revelou um polipeptídeo de 45 kDa, mostrando que a enzima é glicosilada. A glicosilação daenzima também foi observada pelo emprego de corantes comerciais. Além disso, os anticorpos anti-alfa-L-fucosidase imunoprecipitam moléculas com atividade de alfa-L-fucosidase,embora não se tenha observado aumento da atividade, possivelmente devido à perda de atividade da enzima nas condições empregadas durante a imunoprecipitação. Os anticorpos anti-alfa-L-fucosidase reconhecem, por imunofluorescência indireta, tanto as formas epimastigotas como tripomastigotas de cultura de tecido. A análise por microscopia de transmissão mostra a reatividade intensa do anticorpo com uma região membranar localizada na região posterior do epimastigota. No caso do tripomastigota, a reatividade é menos pronunciada mostrando uma leve marcação no interior do parasita.Alpha-L-fucose is a component of glycoproteins, inc1uding glycoproteins isolated from Tcruzi. a-L fucosidases have been isolated from different sources, but earlier studies were unable to detect this enzyme in T. cruzi epimastigotes (AVILA et al., 1979). In this work immunocytochemical and biochemical techniques have been used to localize and characterize a membrane-associated, neutral-pH-optimum alpha-L fucosidase from Trypanosoma cruzi epimastigotes. Light and electron microscopy specifically localized the alpha-L fucosidase on membranes in the posterior region of the epimastigotes and on the parasite surface. Immunoreactivity for alpha-L-fucosidase, a1though less intense, was also detected on the surface of trypomastigotes. Fractionation of epimastigotes homogenates indicated that over 50% of the a-Lfucosidase activity was associated with the 80 000 g pellet. This pellet-associated activity could be solubilized with 1 M NaCl or with 1% Triton X-I 00, suggesting that alpha-L-fucosidase is peripherally associated with membranes. Analysis of alpha-L-fucosidase on epimastigote extracts indicated that the enzyme had a pH-activity curve (with an optimum near 7) which was comparable to other alpha-L-fucosidases reported in the literature. A higher specific activity (in units/mg) was found in epimastigotes as compared to the other differentiation stages of the parasite: 0.028 for epimastigotes, 0.002 for metacyc1ic trypomastigotes and 0.015 for tissue - cultured trypomastigotes. SDS/PAGE and Westem blotting analysis indicated that epimastigotes have a protein band of 50 kDa which was immunoreactive with anti-alpha-L-fucosidase antibodies

β-D-galactofuranosidase: Purification of the Penicillium fellutanum enzyme and its detection in Trypanosoma cruzi

A β-D-galactofuranose é um componente de várias macromoléculas de muitos organismos, incluindo bactérias, protozoários e fungos. Interessantemente este carboidrato não usual está ausente de glicoconjugados de mamíferos. Um método alternativo foi utilizado para purificar a β-D-galactofuranosidase utilizando p-nitrofenil-β-D-galactofuranosideo como substrato. O meio de cultura concentrado do fungo Penicillium fellutanum foi cromatografado em coluna de DEAE-Sepharose CL 6B, seguido de cromatografia em coluna de afinidade de 4-aminofenil-1-tio-β-D-galactofuranosideo-Sepharose, que permitiu a separação de dois picos com atividade enzimática após a eluição com D-galactônico-γ-lactona em um gradiente de 100 a 500 mM de NaCl. Os dois picos resultaram, quando analisados por SDS-PAGE, em um polipeptídeo de 70 kDa. Anticorpos produzidos contra a mistura das bandas recortadas do gel são capazes de imunoprecipitar 77 % das unidades totais de enzima. Uma das bandas recortadas foi submetida a microseqüenciamento, obtendo-se seqüências para 3 peptídeos (65, 73, 101). Anticorpos foram produzidos contra os peptídeos sintéticos e usados para imunoprecipitar um polipeptídeo com atividade de β-D-galactofuranosidase. Para verificar a presença de β-D-galactofuranosidase em T. cruzi, usamos a mesma coluna de afinidade de 4-aminofenil-1-tio-β-D-galactofuranosideo-Sepharose. Um extrato de formas epimastigotas marcadas metabolicamente com 35S-metionina foi aplicado na coluna de afinidade. A enzima foi eluída após a lavagem com D-galactônico-γ-lactona em um gradiente de NaCl 100 a 500 mM. A análise por SDS-PAGE do material eluido mostrou um polipeptídeo de massa molecular aparente 50-60 kDa que é reconhecido por anticorpos anti-β-D-galactofuranosidase. Os anticorpos reagem por imunoflorescência indireta também com parasitas fixados com paraformaldeído. O polipeptídio de 50-60 kDa foi empregado em ensaios de atividade enzimática. Praticamente nenhuma atividade foi detectada utilizando-se p-nitrofenil-β-D-galactofuranosideo como substrato. A LPPG (lipopeptideofosfoglicana), um glicoconjugado isolado de epimastigotas de T. cruzi foi empregada como substrato. A galactopiranose, produto da hidrólise da atividade enzimática, foi detectada por cromatografia de troca iônica em alto pH sugerindo a presença de β-D-galactofuranosidase em T.cruzi.β-D-galactofuranose is a component of several galactofuranose containing macromolecules of many organisms, including bacteria, protozoa and fungi. Interestingly, this unusual sugar is absent in mammalian glycoconjugates. An alternative and fast method for the purification of β-D-galactofuranosidase was developed using p-nitrophenyl-β-D-galactofuranoside as substrate. A concentrated culture medium from Penicillium fellutanum was chromatographed on DEAE-Sepharose CL 6B followed by an affinity chromatography column of 4-aminophenyl-1-thio-β-D-galactofuranoside-Sepharose which yielded two separate peaks of enzyme activity when elution was performed with 10mM D-galactonic acid-γ-lactone in a 100-500 mM NaCl gradient. Both peaks rendered a single 70 kDa protein as detected by SDS-PAGE. Antibodies elicited against a mixture of the single bands excised from the gel were capable to immunoprecipitate 77 % units out of total units of the enzyme from the crude extract. One of the excised bands was submited to microsequencing and the sequence for 3 peptides (65, 73, 101) was obtained. Antibodies were raised against the corresponding synthetic peptides and used to immunoprecipitade a polypeptide with β-D-galactofuranosidase activity. To verify the presence of β-D-galactofuranosidase in T. cruzi we used the same 4-aminophenyl-1-thio-β-D-galactofuranoside-Sepharose affinity column. An extract of epimastigotes metabolically labelled with 35S-methionine was applied on the affinity colunm. After washing, the putative enzyme was eluted by 10 mM D-galactonic acidy-γ-lactone and 100-500 mM NaCl gradient. SDS-PAGE analysis of the eluted material show a polypeptide with an apparent molecular mass of 50-60 kDa that is recognized by all the antibodies raised against β-D-galactofuranosidase from P. fellutanum. Also the antibodies react with p-formaldehyde fixed parasites as detected by indirect immunofluorescence. The 50-60 kDa polypeptide was then employed in enzymatic assays. Almost no enzymatic activity was observed when p-nitrophenyl galactofuranoside was employed as substrate. LPPG (lipopeptidophosphoglycan), a galactofuranose-con taining glycoconjugate isolated from epimastigotes of T. cruzi was then employed as substrate. Galactopyranose, the product of the enzymatic activity, was detected by high pH anion-exchange chromatography, suggesting the presence of β-D-galactofuranosidase in T. cruzi