Caracterização molecular e epidemiológica dos Enterovírus e Parechovírus humanos causadores das meningites virais no Município de Curitiba e Região Metropolitana, no período de julho de 2005 a dezembro de 2006.

Orientadora : Profa. Dra. Iara José Taborda de Messias-ReasonCoorientador: Prof. Dr. Sérgio Monteiro de AlmeidaTese (doutorado) - Universidade Federal do Paraná, Setor de Ciências da Saúde, Programa de Pós-Graduação em Ciências Farmacêuticas. Defesa: Curitiba, 07/12/2011Bibliografia: fls. 115-129Área de concentração: Análises ClínicasResumo: As meningites podem ser causadas por vários agentes etiológicos, sendo as enteroviroses importantes patógenos neurotrópicos em seres humanos. Aproximadamente 90% dos casos de meningites virais são devidos ao grupo dos enterovírus (EV) como coxsackievirus e echovirus que incluem vários sorotipos. Aproximadamente 50% dos internamentos por meningites, nos hospitais de Curitiba, são atribuídos à etiologia viral e 46% desses diagnósticos foram baseados apenas na contagem diferencial de células do líquido cefalorraquidiano (LCR). O presente estudo tem como objetivo definir o perfil epidemiológico e caracterizar molecularmente os EV e parechovírus humano (HPeV), utilizando-se amostras de LCR coletadas de pacientes com sinais e sintomas de meningite viral. Coletou-se 440 amostras de LCR de 3 hospitais da cidade de Curitiba no período de julho de 2005 a junho de 2006. As metodologias utilizadas para o detecção do segmento do genoma 5’ não codificador (5’ NC) do EV ou HPeV foram a transcrição reversa seguida da PCR (RT-PCR) e para o sequenciamento genético, pesquisou-se o gene VP1 para posterior análise filogenética. Além disso, as características bioquímicas e de celularidade do LCR e a coleta dos dados epidemiológicos anotados na ficha epidemiológica, foram analisados. Os EV ou HPeV foram detectados em 49/440 (11%) das amostras de LCR obtidas de pacientes com suspeita clínica de meningite viral por meio da metodologia de RT-PCR. Algumas amostras foram selecionadas em analisadas pela metodologia de PCR em tempo real. A análise das características operacionais da RT-PCR e PCR em Tempo Real definiram os padrões de sensibilidade, especificidade, valor preditivo positivo, valor preditivo negativo, taxa de falso positivo, valor presuntivo positivo, razão de detecção, índice de Youden, razão de erro, erro combinado, razão de verossimilhança positiva e negativa. Observou-se que as amostras positivas por RT-PCR, quando analisadas por meio da metodologia de PCR em Tempo Real, apresentaram uma carga viral mais elevada do que negativas. Observou-se um predomínio de amostras positivas nos intervalos de idades de 7 a 14 anos (41%) e 4 a 6 anos (28,6%), uma paciente de 3 meses apresentou infecção mista por EBV e EV. Ocorreu uma maior circulação dos EV e HPeV nos meses de verão. Por meio do ensaio de sequenciamento genômico observou-se a ocorrência dos tipos virais echovirus 30, echovirus 4 e HPeV. Sendo este o o primeiro relato da circulação do HPeV no Estado do Paraná. Houve uma predominância de amostras negativas (89%), indicando que alguns fatores limitaram a detecção do genoma viral. Observou-se que as amostras negativas apresentaram um número de hemácias significativamente maiores, o tempo de coleta após o inicio dos sintomas, nessas amostras foi menor em relação às amostras positivas. Além disso, outros agentes, como, bactérias, fungos e parasitas podem ser agentes etiológicos das meningites. Neste estudo, utilizou-se as metodologias de RT-PCR e PCR em Tempo Real para a identificação dos EV e HPeV nas amostras de LCR nos pacientes com suspeita clínica de meningite viral. A genotipagem por meio da metodologia de RT-PCR e o sequenciamento genômico da porção VP1 apresentaram as vantagens de conveniência, rapidez e acurácia. O quê permitirá a investigação dos EV ou HPeV e os diferentes sorotipos ou genótipos associados a surtos e complicações clínicas.Abstract: Neurotropic enteroviruses are important human pathogens of meningitis and around 90% of the cases are due to coxsackievirus and echovirus. In Curitiba approximately 50% of hospitalization cases of meningitis are attributed to viruses which were diagnosing mainly (46%) based on differential cell count of cerebrospinal fluid (CSF). The aim of the study was to define the epidemiological profile and the molecular characterization of enterovirus (EV) and human parechovirus HPeV, in CSF samples collected from patients with signs and symptoms of viral meningitis. A total of 440 CSF samples were collected from three hospitals in the period of July 2005 to June 2006. The detection of the genomic portion 5' non-coding (5’NCR) of the EV genome was performed using reverse transcription followed by PCR (RT-PCR). In addition, VP1 gene was amplified for further phylogenetic analysis. Cellular and biochemical characteristics of CSF, as well as, epidemiological were also analyzed. EV or HPeV were detected in 49/440 (11%) of the by RT-PCR methodology. Some were analyzed by the methodology of real time PCR. The analysis of the operational characteristics of the RT-PCR and Real-Time PCR include the following parameters of sensitivity, specificity, positive predictive value, negative predictive value, false positive rate, value presumptive positive rate of detection, Youden index, ratio error, combined error, likelihood ratio positive and negative. Positive samples for EV and HPeV by RT-PCR showed higher viral load than negative samples. There was a predominance of positive samples in the range of age 7 to 14 years (41%) and 4 to 6 years (28.6%). A patient with three months old presented mixed infection by EBV and EV. A higher circulation of the EV and HPeV was observed during the summer months. By genomic sequencing the types: echovirus 30, echovirus 4 and HpeV were detected. The predominance of negative results (89%) in the study indicates that some factors limited the detection of viral genome in CSF samples. In fact, negative samples had a significantly higher number of red blood cells and the collection time after the onset of symptoms in these samples was lower compared to the positive samples. In addition, other agents, such as bacteria, fungi and parasites could also be related to the etiologic agents of meningitis. In this study, it were used the methodologies of RTPCR and real time PCR to identify EV and HPeV in CSF samples from patients suspected of viral meningitis. The genotyping by RT-PCR and VP1 sequencing have the advantage of convenience, speed and accuracy. This will allow examination of EV or HPeV and serotypes or genotypes associated with outbreaks and significant disease witn clinical complications

Incidencia, sazonalidade e caracterizaçao antigenica de amostras de vírus influenza isoladas na cidade de Curitiba no período de 2000 a 2003

Orientadora : Libera Maria Dalla CostaCo-orientadora : Marilda Mendonça de SiqueiraDissertaçao (mestrado) - Universidade Federal do Paraná, Setor de Ciencias da Saúde, Programa de Pós-Graduaçao em Ciencias Farmaceuticas. Defesa: Curitiba, 2004Inclui bibliografiaResumo: O vírus influenza é um dos principais agentes etiológicos das doenças respiratórias, sendo responsável, por altas taxas de mortalidade e morbidade em todo o mundo, em indivíduos de todas as faixas etárias. São poucos os dados da prevalência das infecções por vírus influenza em pacientes pediátricos, imunossuprimidos e ambulatoriais em nosso país. Recentemente tem se procurado estabelecer uma vigilância destas infecções em nossa comunidade pelo sistema de informação de vigilância epidemiológica do vírus influenza no Brasil. Com o objetivo de avaliar a incidência e subtipar os vírus influenza, na cidade de Curitiba, realizou-se o presente estudo. Foram analisadas amostras de aspirados de nasofaringe ou lavado broncoalveolar, no período de 2000 a 2003, de pacientes ambulatoriais, das unidades de saúde, imunossuprimidos da Unidade de Transplante de Medula Óssea do Hospital de Clínicas da Universidade Federal do Paraná, e hospitalizados em outras unidades. O isolamento do vírus foi realizado pela metodologia de Shell Vial (SV), a técnica de imunofluorescência indireta (IFI) para a tipagem, e a subtipagem foi realizada pela técnica de transcrição reversa e reação em cadeia da polimerase (RT-PCR). Avaliou-se um total de 1621 amostras, com uma positividade de 8,3% para o vírus influenza, por "Shell Vial" e/ou imunofluorescência indireta, sendo 76,3% para o tipo A e 23,7% para o tipo B. Observou-se que, neste período circularam os subtipos H1, H3 do tipo A e também, o tipo B, utilizando-se as técnicas de transcrição reversa e reação em cadeia da polimerase. Os resultados obtidos possibilitaram avaliar dados de incidência, sazonalidade, perfis demográficos e clínicos relacionados ao vírus influenza na cidade de Curitiba.Abstract: Influenza virus is one of the important agents in the etiology of respiratory infections, they are responsible for high rates of morbidity and mortality all over the world, in persons of all ages. There are few data about the incidence of influenza virus in pediatrics, immunosupressed and out patients in our country. Recently, local health community is trying to establish a surveillance programme about the virus in our region. In order to measure the incidence, seasonality and subtype the influenza virus in Curitiba city, the present study was performed. It was analyzed nasopharingeal aspirates and broncoalveolar lavage, in the period of 2000 to 2003, from outpatients, form health unit, immunosupressed patients from Bone Marrow Transplant Unit from General Hospital from Federal University and hospitalized ones from others units. The virus isolation were made by Shell Vial (SV) methodology, the indirect immunofluorescence (IFI) to type the virus, and to subtype the virus it was performed the reverse transcription and polymerase chain reaction methodologies. A total of 1621 samples were analyzed, with 8,3% of positive samples for influenza virus, from that 76,3% for type A and 23,7% for type B. It was observed that in this period, subtypes H1 and H3 for type A and type B virus were circulated, using the transcriptase reverse and polymerase chain reaction. The results permit to establish incidence, seasonality, demographic and clinical data related with influenza virus infections in Curitiba city

Caracterização molecular e epidemiológica dos Enterovírus e Parechovírus humanos causadores das meningites virais no Município de Curitiba e Região Metropolitana, no período de julho de 2005 a dezembro de 2006.

Orientadora : Profa. Dra. Iara José Taborda de Messias-ReasonCoorientador: Prof. Dr. Sérgio Monteiro de AlmeidaTese (doutorado) - Universidade Federal do Paraná, Setor de Ciências da Saúde, Programa de Pós-Graduação em Ciências Farmacêuticas. Defesa: Curitiba, 07/12/2011Bibliografia: fls. 115-129Área de concentração: Análises ClínicasResumo: As meningites podem ser causadas por vários agentes etiológicos, sendo as enteroviroses importantes patógenos neurotrópicos em seres humanos. Aproximadamente 90% dos casos de meningites virais são devidos ao grupo dos enterovírus (EV) como coxsackievirus e echovirus que incluem vários sorotipos. Aproximadamente 50% dos internamentos por meningites, nos hospitais de Curitiba, são atribuídos à etiologia viral e 46% desses diagnósticos foram baseados apenas na contagem diferencial de células do líquido cefalorraquidiano (LCR). O presente estudo tem como objetivo definir o perfil epidemiológico e caracterizar molecularmente os EV e parechovírus humano (HPeV), utilizando-se amostras de LCR coletadas de pacientes com sinais e sintomas de meningite viral. Coletou-se 440 amostras de LCR de 3 hospitais da cidade de Curitiba no período de julho de 2005 a junho de 2006. As metodologias utilizadas para o detecção do segmento do genoma 5’ não codificador (5’ NC) do EV ou HPeV foram a transcrição reversa seguida da PCR (RT-PCR) e para o sequenciamento genético, pesquisou-se o gene VP1 para posterior análise filogenética. Além disso, as características bioquímicas e de celularidade do LCR e a coleta dos dados epidemiológicos anotados na ficha epidemiológica, foram analisados. Os EV ou HPeV foram detectados em 49/440 (11%) das amostras de LCR obtidas de pacientes com suspeita clínica de meningite viral por meio da metodologia de RT-PCR. Algumas amostras foram selecionadas em analisadas pela metodologia de PCR em tempo real. A análise das características operacionais da RT-PCR e PCR em Tempo Real definiram os padrões de sensibilidade, especificidade, valor preditivo positivo, valor preditivo negativo, taxa de falso positivo, valor presuntivo positivo, razão de detecção, índice de Youden, razão de erro, erro combinado, razão de verossimilhança positiva e negativa. Observou-se que as amostras positivas por RT-PCR, quando analisadas por meio da metodologia de PCR em Tempo Real, apresentaram uma carga viral mais elevada do que negativas. Observou-se um predomínio de amostras positivas nos intervalos de idades de 7 a 14 anos (41%) e 4 a 6 anos (28,6%), uma paciente de 3 meses apresentou infecção mista por EBV e EV. Ocorreu uma maior circulação dos EV e HPeV nos meses de verão. Por meio do ensaio de sequenciamento genômico observou-se a ocorrência dos tipos virais echovirus 30, echovirus 4 e HPeV. Sendo este o o primeiro relato da circulação do HPeV no Estado do Paraná. Houve uma predominância de amostras negativas (89%), indicando que alguns fatores limitaram a detecção do genoma viral. Observou-se que as amostras negativas apresentaram um número de hemácias significativamente maiores, o tempo de coleta após o inicio dos sintomas, nessas amostras foi menor em relação às amostras positivas. Além disso, outros agentes, como, bactérias, fungos e parasitas podem ser agentes etiológicos das meningites. Neste estudo, utilizou-se as metodologias de RT-PCR e PCR em Tempo Real para a identificação dos EV e HPeV nas amostras de LCR nos pacientes com suspeita clínica de meningite viral. A genotipagem por meio da metodologia de RT-PCR e o sequenciamento genômico da porção VP1 apresentaram as vantagens de conveniência, rapidez e acurácia. O quê permitirá a investigação dos EV ou HPeV e os diferentes sorotipos ou genótipos associados a surtos e complicações clínicas.Abstract: Neurotropic enteroviruses are important human pathogens of meningitis and around 90% of the cases are due to coxsackievirus and echovirus. In Curitiba approximately 50% of hospitalization cases of meningitis are attributed to viruses which were diagnosing mainly (46%) based on differential cell count of cerebrospinal fluid (CSF). The aim of the study was to define the epidemiological profile and the molecular characterization of enterovirus (EV) and human parechovirus HPeV, in CSF samples collected from patients with signs and symptoms of viral meningitis. A total of 440 CSF samples were collected from three hospitals in the period of July 2005 to June 2006. The detection of the genomic portion 5' non-coding (5’NCR) of the EV genome was performed using reverse transcription followed by PCR (RT-PCR). In addition, VP1 gene was amplified for further phylogenetic analysis. Cellular and biochemical characteristics of CSF, as well as, epidemiological were also analyzed. EV or HPeV were detected in 49/440 (11%) of the by RT-PCR methodology. Some were analyzed by the methodology of real time PCR. The analysis of the operational characteristics of the RT-PCR and Real-Time PCR include the following parameters of sensitivity, specificity, positive predictive value, negative predictive value, false positive rate, value presumptive positive rate of detection, Youden index, ratio error, combined error, likelihood ratio positive and negative. Positive samples for EV and HPeV by RT-PCR showed higher viral load than negative samples. There was a predominance of positive samples in the range of age 7 to 14 years (41%) and 4 to 6 years (28.6%). A patient with three months old presented mixed infection by EBV and EV. A higher circulation of the EV and HPeV was observed during the summer months. By genomic sequencing the types: echovirus 30, echovirus 4 and HpeV were detected. The predominance of negative results (89%) in the study indicates that some factors limited the detection of viral genome in CSF samples. In fact, negative samples had a significantly higher number of red blood cells and the collection time after the onset of symptoms in these samples was lower compared to the positive samples. In addition, other agents, such as bacteria, fungi and parasites could also be related to the etiologic agents of meningitis. In this study, it were used the methodologies of RTPCR and real time PCR to identify EV and HPeV in CSF samples from patients suspected of viral meningitis. The genotyping by RT-PCR and VP1 sequencing have the advantage of convenience, speed and accuracy. This will allow examination of EV or HPeV and serotypes or genotypes associated with outbreaks and significant disease witn clinical complications

Incidencia, sazonalidade e caracterizaçao antigenica de amostras de vírus influenza isoladas na cidade de Curitiba no período de 2000 a 2003

Orientadora : Libera Maria Dalla CostaCo-orientadora : Marilda Mendonça de SiqueiraDissertaçao (mestrado) - Universidade Federal do Paraná, Setor de Ciencias da Saúde, Programa de Pós-Graduaçao em Ciencias Farmaceuticas. Defesa: Curitiba, 2004Inclui bibliografiaResumo: O vírus influenza é um dos principais agentes etiológicos das doenças respiratórias, sendo responsável, por altas taxas de mortalidade e morbidade em todo o mundo, em indivíduos de todas as faixas etárias. São poucos os dados da prevalência das infecções por vírus influenza em pacientes pediátricos, imunossuprimidos e ambulatoriais em nosso país. Recentemente tem se procurado estabelecer uma vigilância destas infecções em nossa comunidade pelo sistema de informação de vigilância epidemiológica do vírus influenza no Brasil. Com o objetivo de avaliar a incidência e subtipar os vírus influenza, na cidade de Curitiba, realizou-se o presente estudo. Foram analisadas amostras de aspirados de nasofaringe ou lavado broncoalveolar, no período de 2000 a 2003, de pacientes ambulatoriais, das unidades de saúde, imunossuprimidos da Unidade de Transplante de Medula Óssea do Hospital de Clínicas da Universidade Federal do Paraná, e hospitalizados em outras unidades. O isolamento do vírus foi realizado pela metodologia de Shell Vial (SV), a técnica de imunofluorescência indireta (IFI) para a tipagem, e a subtipagem foi realizada pela técnica de transcrição reversa e reação em cadeia da polimerase (RT-PCR). Avaliou-se um total de 1621 amostras, com uma positividade de 8,3% para o vírus influenza, por "Shell Vial" e/ou imunofluorescência indireta, sendo 76,3% para o tipo A e 23,7% para o tipo B. Observou-se que, neste período circularam os subtipos H1, H3 do tipo A e também, o tipo B, utilizando-se as técnicas de transcrição reversa e reação em cadeia da polimerase. Os resultados obtidos possibilitaram avaliar dados de incidência, sazonalidade, perfis demográficos e clínicos relacionados ao vírus influenza na cidade de Curitiba.Abstract: Influenza virus is one of the important agents in the etiology of respiratory infections, they are responsible for high rates of morbidity and mortality all over the world, in persons of all ages. There are few data about the incidence of influenza virus in pediatrics, immunosupressed and out patients in our country. Recently, local health community is trying to establish a surveillance programme about the virus in our region. In order to measure the incidence, seasonality and subtype the influenza virus in Curitiba city, the present study was performed. It was analyzed nasopharingeal aspirates and broncoalveolar lavage, in the period of 2000 to 2003, from outpatients, form health unit, immunosupressed patients from Bone Marrow Transplant Unit from General Hospital from Federal University and hospitalized ones from others units. The virus isolation were made by Shell Vial (SV) methodology, the indirect immunofluorescence (IFI) to type the virus, and to subtype the virus it was performed the reverse transcription and polymerase chain reaction methodologies. A total of 1621 samples were analyzed, with 8,3% of positive samples for influenza virus, from that 76,3% for type A and 23,7% for type B. It was observed that in this period, subtypes H1 and H3 for type A and type B virus were circulated, using the transcriptase reverse and polymerase chain reaction. The results permit to establish incidence, seasonality, demographic and clinical data related with influenza virus infections in Curitiba city

Viral acute gastroenteritis: clinical and epidemiological features of co-infected patients

BACKGROUND: Acute gastroenteritis (AGE) is a common disorder that affects children worldwide. It is usually caused by viral agents, including rotavirus, enteric adenovirus, norovirus, and astrovirus groups. Currently, there are few reports about co-infection among these viruses, mainly in Brazil. METHODS: This is a retrospective study in which 84 rotavirus-positive samples from hospitalized patients at a teaching hospital in Southern Brazil, collected in the 2001-2010 period, were analyzed by polymerase chain reaction (PCR) and reverse transcription - polymerase chain reaction (RT-PCR), for the investigation of enteric adenovirus, astrovirus, and norovirus. RESULTS: In total, 12 of the 84 (14%) samples were positive to enteric adenovirus or norovirus. Clinical, laboratory, and demographic data showed statistically significant differences between mono and co-infected patients, including age and depletion rate. CONCLUSIONS: These findings highlight the need for implementation of other enteric virus detection assays in clinical diagnosis for a complete laboratory investigation of hospitalized pediatric patients with AGE, in order to understand the impact of these pathogens on disease severity, spread within hospital, and consequently, prevent the dissemination of nosocomial infections

HIV-1C and HIV-1B Tat protein polymorphism in Southern Brazil.

The transactivator of transcription (Tat) is a key HIV regulatory protein. We aimed to identify the frequency of key polymorphisms in HIV-1C compared with HIV-1B Tat protein, chiefly in the cysteine-, arginine-, and glutamine-rich domains and identify novel point mutations in HIV-1B and C sequences from Southern Brazil. This study was the first to investigate the genetic diversity and point mutations within HIV-1 Tat C in a Brazilian cohort. This was an observational, cross-sectional study, which included sequences of HIV-1B (n = 20) and HIV-1C (n = 21) from Southern Brazil. Additionally, 344 HIV-1C sequences were obtained from the Los Alamos database: 29 from Brazil and 315 from Africa, Asia, and Europe. The frequency of C31S substitution on HIV-1 Tat C in Brazil was 82% vs. 10% in the HIV-1B group (p < 0.0001). The frequency of the R57S substitution among the HIV-1C sequences from Brazil was 74% vs. 20% in HIV-1B (p = 0.004), and that of substitution Q63E in HIV-1C was 80% and 20% in HIV-1B (p < 0.0001). The mutation P60Q was more frequent in HIV-1B than in HIV-1C (55% and 6.12%, respectively, p < 0.0001)). Novel point mutations in the HIV-1C and B Tat functional domains were described. The frequency of C31S and other key point mutations in HIV-1 Tat C in Brazil were similar to those described in Africa, although lower than those in India. The Tat-B and C sequences found in Southern Brazil are consistent with biological differences and have potential implications for HIV-1 subtype pathogenesis

Profile of HIV subtypes in HIV/HBV- and HIV/HCV-coinfected patients in Southern Brazil

Abstract INTRODUCTION: HIV and viral hepatitis infections are major causes of chronic disease worldwide and have some similarities with regard to routes of transmission, epidemiology, front barriers faced during access of treatment, and strategies for a global public health response. The objective was to describe the HIV-1 subtypes, viral tropism and single-nucleotide polymorphisms (SNPs) of interleukin 28B (IL28B) from a case series of HIV/viral hepatitis coinfected patients from southern Brazil. METHODS: Clinical and epidemiological data were evaluated by a review of medical records. Periodic blood draws were taken to determine the viral and host characteristics. RESULTS: This study included 38 patients with HIV/HBV or HIV/HCV coinfection; the median age was 49 years. Thirty-seven (97.4%) were on antiretroviral therapy, 32 (84.2%) had an undetectable viral load, a median CD4+ T-cell count of 452 cells/mm3. HIV-1 subtyping showed 47.4 and 31.6% of patients with subtypes C and B, respectively. Analysis of viral co-receptor usage showed a predominance of the R5 variant (64.7%), with no significant difference between the subtypes. Twenty patients with HIV/HCV coinfection were eligible to receive HCV therapy with pegylated-interferon-alpha plus ribavirin, and 10/20 (50%) of them achieved sustained virological response. SNPs of IL28B were evaluated in 93.3% of patients with HIV/HCV coinfection, and 17 (60.7%) presented the CC genotype. CONCLUSIONS: In the present case series, a higher frequency of HIV subtype C was found in coinfected patients. However such findings need to be prospectively evaluated with the inclusion of data from regional multicenter analyses

Enterovirus and herpesviridae family as etiologic agents of lymphomonocytary meningitis, Southern Brazil

Viral meningitis is a common infectious disease of the central nervous system (CNS) that occurs worldwide. The aim of this study was to identify the etiologic agent of lymphomonocytary meningitis in Curitiba, PR, Brazil. During the period of July 2005 to December 2006, 460 cerebrospinal fluid (CSF) samples with lymphomonocytary meningitis were analyzed by PCR methodologies. Fifty nine (12.8%) samples were positive. Enteroviruses was present in 49 (83%) samples and herpes virus family in 10 (17%), of these 6 (10%) herpes simplex virus, 1 (2%) Epstein Barr virus, 2 (3%) human herpes virus type 6 and 1 (2%) mixed infection of enterovirus and Epstein Barr virus. As conclusion enterovirus was the most frequent virus, with circulation during summer and was observed with higher frequency between 4 to 17 years of age. PCR methodology is an important method for rapid detection of RNA enterovirus and DNA herpesvirus in CSF