Accelerated oxygen-induced retinopathy is a reliable model of ischemia-induced retinal neovascularization

Retinal ischemia and pathological angiogenesis cause severe impairment of sight. Oxygen-induced retinopathy (OIR) in young mice is widely used as a model to investigate the underlying pathological mechanisms and develop therapeutic interventions. We compared directly the conventional OIR model (exposure to 75% O-2 from postnatal day (P) 7 to P12) with an alternative, accelerated version (85% O-2 from P8 to P11). We found that accelerated OIR induces similar pre-retinal neovascularization but greater retinal vascular regression that recovers more rapidly. The extent of retinal gliosis is similar but neuroretinal function, as measured by electroretinography, is better maintained in the accelerated model. We found no systemic or maternal morbidity in either model. Accelerated OIR offers a safe, reliable and more rapid alternative model in which pre-retinal neovascularization is similar but retinal vascular regression is greater

Multimodal analysis of ocular inflammation using the endotoxin-induced uveitis mouse model

Endotoxin-induced uveitis (EIU) in rodents is a model of acute Toll-like receptor 4 (TLR4)-mediated organ inflammation, and has been used to model human anterior uveitis, examine leukocyte trafficking and test novel anti-inflammatory therapeutics. Wider adoption has been limited by the requirement for manual, non-specific, cell-count scoring of histological sections from each eye as a measure of disease severity. Here, we describe a comprehensive and efficient technique that uses ocular dissection and multimodal tissue analysis. This allows matched disease scoring by multicolour flow cytometric analysis of the inflammatory infiltrate, protein analysis on ocular supernatants and qPCR on remnant tissues of the same eye. Dynamic changes in cell populations could be identified and mapped to chemokine and cytokine changes over the course of the model. To validate the technique, dose-responsive suppression of leukocyte infiltration by recombinant interleukin-10 was demonstrated, as well as selective suppression of the monocyte (CD11b+Ly6C+) infiltrate, in mice deficient for either Ccl2 or Ccr2. Optical coherence tomography (OCT) was used for the first time in this model to allow in vivo imaging of infiltrating vitreous cells, and correlated with CD11b+Ly6G+ counts to provide another unique measure of cell populations in the ocular tissue. Multimodal tissue analysis of EIU is proposed as a new standard to improve and broaden the application of this model

Differential Modulation of Retinal Degeneration by Ccl2 and Cx3cr1 Chemokine Signalling

Microglia and macrophages are recruited to sites of retinal degeneration where local cytokines and chemokines determine protective or neurotoxic microglia responses. Defining the role of Ccl2-Ccr2 and Cx3cl1-Cx3cr1 signalling for retinal pathology is of particular interest because of its potential role in age-related macular degeneration (AMD). Ccl2, Ccr2, and Cx3cr1 signalling defects impair macrophage trafficking, but have, in several conflicting studies, been reported to show different degrees of age-related retinal degeneration. Ccl2/Cx3cr1 double knockout (CCDKO) mice show an early onset retinal degeneration and have been suggested as a model for AMD. In order to understand phenotypic discrepancies in different chemokine knockout lines and to study how defects in Ccl2 and/or Cx3cr1 signalling contribute to the described early onset retinal degeneration, we defined primary and secondary pathological events in CCDKO mice. To control for genetic background variability, we compared the original phenotype with that of single Ccl2, Cx3cr1 and Ccl2/Cx3cr1 double knockout mice obtained from backcrosses of CCDKO with C57Bl/6 mice. We found that the primary pathological event in CCDKO mice develops in the inferior outer nuclear layer independently of light around postnatal day P14. RPE and vascular lesions develop secondarily with increasing penetrance with age and are clinically similar to retinal telangiectasia not to choroidal neovascularisation. Furthermore, we provide evidence that a third autosomal recessive gene causes the degeneration in CCDKO mice and in all affected re-derived lines and subsequently demonstrated co-segregation of the naturally occurring RD8 mutation in the Crb1 gene. By comparing CCDKO mice with re-derived CCl2−/−/Crb1Rd8/RD8, Cx3cr1−/−/Crb1Rd8/RD8 and CCl2−/−/Cx3cr1−/−/Crb1Rd8/RD8 mice, we observed a differential modulation of the retinal phenotype by genetic background and both chemokine signalling pathways. These findings indicate that CCDKO mice are not a model of AMD, but a model for an inherited retinal degeneration that is differentially modulated by Ccl2-Ccr2 and Cx3cl1-Cx3cr1 chemokine signalling

Water Managers' Boundary Judgments and Adaptive Water Governance. An Analysis of the Dutch Haringvliet Sluices Case

__Abstract__ In this paper, we explore how managing actors' boundary judgments influence the adaptability of water governance. We approach this question by examining the relationship between the way water managers frame, and act in, complex water issues on the one hand and develop adaptive water governance strategies on the other. We define four categories of boundary judgments made by water managers in order to deal with the complexities in water governance issues. An in-depth case study analysis of an attempt to adjust the management of the water regime in the south-west Delta of the Netherlands is provided in order to reconstruct the water managers' boundary judgments and their impact upon governance strategies used. We found that, most of the time, the water managers involved predominantly made tight boundary judgments. These tight boundary judgments seemed to hamper the mutual learning process among a variety of stakeholders that is needed to realize adaptive water governance. We argue that wide boundary judgments enhance the chance of realizing adaptive practices and build upon exploration, learning, and connection

The severity of retinal pathology in homozygous Crb1rd8/rd8 mice is dependent on additional genetic factors

Understanding phenotype–genotype correlations in retinal degeneration is a major challenge. Mutations in CRB1 lead to a spectrum of autosomal recessive retinal dystrophies with variable phenotypes suggesting the influence of modifying factors. To establish the contribution of the genetic background to phenotypic variability associated with the Crb1(rd8/rd8) mutation, we compared the retinal pathology of Crb1(rd8/rd8)/J inbred mice with that of two Crb1(rd8/rd8) lines backcrossed with C57BL/6JOlaHsd mice. Topical endoscopic fundal imaging and scanning laser ophthalmoscopy fundus images of all three Crb1(rd8/rd8) lines showed a significant increase in the number of inferior retinal lesions that was strikingly variable between the lines. Optical coherence tomography, semithin, ultrastructural morphology and assessment of inflammatory and vascular marker by immunohistochemistry and quantitative reverse transcriptase-polymerase chain reaction revealed that the lesions were associated with photoreceptor death, Müller and microglia activation and telangiectasia-like vascular remodelling—features that were stable in the inbred, variable in the second, but virtually absent in the third Crb1(rd8/rd8) line, even at 12 months of age. This suggests that the Crb1(rd8/rd8) mutation is necessary, but not sufficient for the development of these degenerative features. By whole-genome SNP analysis of the genotype–phenotype correlation, a candidate region on chromosome 15 was identified. This may carry one or more genetic modifiers for the manifestation of the retinal pathology associated with mutations in Crb1. This study also provides insight into the nature of the retinal vascular lesions that likely represent a clinical correlate for the formation of retinal telangiectasia or Coats-like vasculopathy in patients with CRB1 mutations that are thought to depend on such genetic modifiers

Gpr124 is essential for blood-brain barrier integrity in central nervous system disease

Although blood-brain barrier (BBB) compromise is central to the etiology of diverse central nervous system (CNS) disorders, endothelial receptor proteins that control BBB function are poorly defined. The endothelial G-protein-coupled receptor (GPCR) Gpr124 has been reported to be required for normal forebrain angiogenesis and BBB function in mouse embryos, but the role of this receptor in adult animals is unknown. Here Gpr124 conditional knockout (CKO) in the endothelia of adult mice did not affect homeostatic BBB integrity, but resulted in BBB disruption and microvascular hemorrhage in mouse models of both ischemic stroke and glioblastoma, accompanied by reduced cerebrovascular canonical Wnt-β-catenin signaling. Constitutive activation of Wnt-β-catenin signaling fully corrected the BBB disruption and hemorrhage defects of Gpr124-CKO mice, with rescue of the endothelial gene tight junction, pericyte coverage and extracellular-matrix deficits. We thus identify Gpr124 as an endothelial GPCR specifically required for endothelial Wnt signaling and BBB integrity under pathological conditions in adult mice. This finding implicates Gpr124 as a potential therapeutic target for human CNS disorders characterized by BBB disruption

Elucidation of Molecular Pathogenic Mechanisms of Norrie Disease

# I. # Inhaltsverzeichnis # 0. Titelblatt, Danksagung und Verzeichnisse ### I. ### INHALTSVERZEICHNIS ### IV ### II. ### ABBILDUNGSVERZEICHNIS ### VII ### III. ### ABKÜRZUNGSVERZEICHNIS ### IX 1 EINLEITUNG 1 ### 1.1 ### Die Anatomie des menschlichen Auges ### 1 #### 1.1.1 #### Der Aufbau der Retina und deren Blutgefäßversorgung #### 2 ### 1.2 ### Klinik und Genetik des Norrie-Syndroms ### 5 #### 1.2.1 #### Das klinische Erscheinungsbild des Norrie-Syndroms #### 5 #### 1.2.2 #### Das NDP-Gen und sein Mutationsspektrum in Patienten #### 7 #### 1.2.3 #### Klinische Gemeinsamkeiten der allelischen Erkrankungen und deren genetische Grundlagen #### 9 ### 1.3 ### Eigenschaften des vorhergesagten NDP-Proteins (Norrin) ### 12 ### 1.4 ### Das Ndph-knockout-Mausmodell ### 15 #### 1.4.1 #### Die Herstellung eines Mausmodells für das Norrie-Syndrom und die Expression des Norrie-Gens in Mausgewebe #### 15 #### 1.4.2 #### Phänotypische Charakterisierung des Mausmodells #### 15 ### 1.5 ### Die retinale Blutgefäßentwicklung in Mensch und Maus ### 17 #### 1.5.1 #### Die Entwicklung der retinalen Blutgefäße in Mensch und Maus #### 17 #### 1.5.2 #### Die Rolle der an der retinalen Blutgefäßentwicklung beteiligten Zelltypen #### 20 #### 1.5.3 #### Die koordinierte Wirkung molekularer Signalwege in der Angiogenese #### 22 ### 1.6 ### Zielsetzung der Arbeit ### 25 2 MATERIAL / METHODEN 26 ### 2.1 ### Tiere ### 26 ### 2.2 ### Gewebepräparation und histologische Techniken ### 26 #### 2.2.1 #### Entnahme und Verarbeitung von Geweben #### 27 #### 2.2.2 #### Fixierung und Paraffineinbettung von Gewebe #### 27 #### 2.2.3 #### Hämalaun/Eosin-Färbung #### 27 ### 2.3 ### DNA-Techniken ### 28 #### 2.3.1 #### Agarosegelelektrophorese zur Auftrennung von Nukleinsäuren #### 30 #### 2.3.2 #### Polymerase-Kettenreaktion (polymerase chain reaction, PCR) #### 30 #### 2.3.3 #### Präparation von Plasmid-DNA #### 31 #### 2.3.4 #### Manipulation von DNA und Transformation von Bakterien #### 31 #### 2.3.5 #### Sequenzierung #### 32 #### 2.3.6 #### Isolation von DNA aus Mausschwanzbiopsien #### 33 #### 2.3.7 #### PCR zur Genotypisierung des Ndph-Wildtyp- oder Knockout-Allels und zur Geschlechtsbestimmung (Sry) #### 33 ### 2.4 ### RNA-Techniken ### 34 #### 2.4.1 #### RNA-Extraktion #### 36 #### 2.4.2 #### Quantifizierung der RNA #### 37 #### 2.4.3 #### DNase I-Behandlung von Total-RNA #### 37 #### 2.4.4 #### DNAse I-Behandlung von Total-RNA (20 μg) mit anschließender Phenol- Chloroform-Extraktion #### 38 #### 2.4.5 #### cDNA-Synthese #### 38 #### 2.4.6 #### TaqMan-Real Time-PCR #### 39 #### 2.4.7 #### Nicht radioaktive RNA-in situ Hybridisierung (DIG) auf Gewebeschnitten #### 40 #### 2.4.8 #### Genexpressionsstudien mit Northern Blots oder virtuellen Northern Blots #### 46 #### 2.4.9 #### Herstellen radioaktiv markierter DNA-Sonden und Hybridisierung von Nukleinsäureblots #### 48 ### 2.5 ### Herstellen einer SMART-cDNA-Subtraktionsbank ### 51 #### 2.5.1 #### Erststrang-SMART-cDNA-Synthese (Smart PCR cDNA Synthesis Kit) #### 56 #### 2.5.2 #### RsaI-Restriktion der SMART-cDNAs #### 58 #### 2.5.3 #### Herstellung des Drivers #### 59 #### 2.5.4 #### Herstellen der Tester #### 60 #### 2.5.5 #### Subtraktive Hybridisierung #### 62 #### 2.5.6 #### "Suppression PCR"-Amplifikation der differentiellen Tester cDNA-Fragmente #### 63 #### 2.5.7 #### Herstellen der Forward- und der Reverse-SMART-cDNA-Subtraktionsbanken #### 65 ### 2.6 ### cDNA-Mikroarray-Techniken ### 66 #### 2.6.1 #### Amplifikation der SMART-cDNA-Subtraktionsbanken zur Herstellung von Mikroarrays #### 68 #### 2.6.2 #### Herstellen der cDNA-Mikroarrays #### 69 #### 2.6.3 #### In dieser Arbeit hergestellte bzw. verwendete cDNA-Mikroarrays #### 70 #### 2.6.4 #### Vorbehandlung der Mikroarrays für die Hybridisierung #### 71 #### 2.6.5 #### Vorbereitung der Targets für die Markierung #### 72 #### 2.6.6 #### Markierung der Targets #### 73 #### 2.6.7 #### Kohybridisierung verschiedener Targets auf cDNA-Mikroarrays #### 76 #### 2.6.8 #### Waschen der Mikroarrays nach der Hybridisierung #### 78 #### 2.6.9 #### Bildgewinnung und Analyse der Mikroarraydaten #### 78 ### 2.7 ### Proteinbiochemische Methoden ### 79 #### 2.7.1 #### Proteinpräparation aus Gewebe #### 82 #### 2.7.2 #### Proteinkonzentrationsbestimmung mit dem Bicinchoninsäure-Assay (BCA- Assay; 560 nm) #### 83 #### 2.7.3 #### Polyacrylamid-Gelelektrophorese (SDS�PAGE) #### 83 #### 2.7.4 #### Nachweis von Proteinen in SDS-Polyacrylamidgelen #### 84 #### 2.7.5 #### Transfer von Proteinen auf eine PVDF-Membran (Western Blot) #### 84 #### 2.7.6 #### Rekombinante Ndph ("Norrin")-Proteinexpression in Escherichia coli #### 85 #### 2.7.7 #### Affinitätschromatographische Aufreinigung des rekombinanten Proteins mit Ni-NTA-Agarose über einen RGS-His-Tag #### 88 #### 2.7.8 #### Immunisierung von Kaninchen mit rekombinantem Norrin zur Antikörpergewinnung #### 89 #### 2.7.9 #### Renaturierung des rekombinanten WND-Proteins für die Verwendung in einem Cornea- Vaskularisations-Assay #### 89 ### 2.8 ### Datenbankanalysen und Computerprogramme ### 90 3 ERGEBNISSE 91 ### 3.1 ### Globale Genexpressionsstudien in Augen von Ndph-knockout-Mäusen (p21) ### 91 #### 3.1.1 #### Herstellung einer Forward- und einer Reverse-cDNA-Subtraktionsbank 91 #### 91 #### 3.1.2 #### Herstellung von cDNA-Mikroarrays 97 #### 97 ### 3.2 ### cDNA-Mikroarray-Hybridisierungsexperimente zur Identifizierung ### von differentiell exprimierten Genen. ### 100 #### 3.2.1 #### Vergleichende Datenanalyse der cDNA-Mikroarraydaten 104 #### 104 #### 3.2.2 #### Verifizierung der Arraydaten mit Hilfe virtueller Northern Blots 112 #### 112 ### 3.3 ### Die postnatale Entwicklung der retinalen Blutgefäße in Ndph-knockout- Mäusen ### 113 #### 3.3.1 #### Histologische Untersuchung der Retinaentwicklung in Ndph-knockout-Mäusen #### 113 #### 3.3.2 #### Expression von Angiogenesefaktoren während der postnatalen Retinaentwicklung #### 115 ### 3.4 ### Histologische Untersuchungen und Genexpressionsanalysen im Gehirn von Ndph-knockout-Mäusen ### 120 #### 3.4.1 #### Histologische Untersuchungen im Gehirn #### 120 #### 3.4.2 #### Analyse der Genexpression im Gehirn mit Hilfe eines cDNA-Mikroarrays #### 122 #### 3.4.3 #### Entwicklungsabhängige Transkription des Wachstumshormon-Gens im Gehirn. #### 125 #### 3.4.4 #### Expression des Wachstumshormons in der Hypophyse #### 126 #### 3.4.5 #### Expression zweier Markergene in der Leber für die Gh-Serum-Wirkung #### 127 #### 3.4.6 #### Korrelation zwischen der mRNA-Expression von Ndph und Gh in verschiedenen Hirnregionen. #### 129 #### 3.4.7 #### Untersuchungen zur Transkription von Gh in Auge und Retina #### 132 ### 3.5 ### Identifizierung eines aberranten Ndph-Transkripts in hemizygoten Ndphy/--Mäusen. ### 133 ### 3.6 ### Die Ursache der Infertilität von homozygoten Ndph-/--Weibchen ### 136 #### 3.6.1 #### Die Transmission des Ndph-knockout-Allels in der Knockout-Mauslinie #### 136 #### 3.6.2 #### Histologische Studien an den Implantationsstellen/ Deziduae im Uterus von Ndph-/--Weibchen nach der Einnistung. #### 137 #### 3.6.3 #### Die Expression von NDP/Ndph in Reproduktionsorganen #### 139 ### 3.7 ### Expression eines rekombinanten Ndph-Proteins (Norrin) in Escherichia coli ### 140 ### 3.8 ### Herstellung polyklonaler Antikörper für Norrin ### 142 ### 3.9 ### Cornea-Vaskularisations-Assay mit rekombinantem Norrin ### 145 4 DISKUSSION 147 ### 4.1 ### Untersuchungen zur Funktion des Ndph-Gens im Auge ### 147 #### 4.1.1 #### Herstellung von cDNA-Subtraktionsbanken und deren Charakterisierung mit Hilfe der Mikroarray-Technik. #### 147 #### 4.1.2 #### Die postnatale Retinaentwicklung in Wildtyp und in Ndph-knockout-Mäusen und die Hypoxie #### als wesentlicher Pathogenesemechanismus des Norrie-Syndroms. #### 149 #### 4.1.3 #### Die molekulare Wirkung des Ndph-Gens im Auge #### 155 ### 4.2 ### Die Untersuchungen zur Funktion des Ndph-Gens im Gehirn � Die Dysregulation des Wachstumshormons im Gehirn könnte dem Phänotyp der mentalen Retardierung zu Grunde liegen ### 158 #### 4.2.1 #### Histologische Untersuchung des Gehirns #### 158 #### 4.2.2 #### Globale Genexpressionsstudien im Gehirn von Wildtyp- und Ndph-knockout- Mäusen #### 158 #### 4.2.3 #### Differentielle Genexpression in verschiedenen Hirnregionen als mögliche Ursache der geistigen Behinderung in Norrie-Patienten. #### 160 #### 4.2.4 #### Die Detektion eines artifiziellen Ndph-Fusionstranskripts in Ndph- knockout-Mäusen und die Konsequenzen für das Mausmodell. #### 163 ### 4.3 ### Untersuchungen zur Rolle des Norrins für die Fertilität ### 164 #### 4.3.1 #### Genotypenverteilung #### 165 #### 4.3.2 #### Die Rolle des Norrins während der Dezidua-Bildung #### 165 ### 4.4 ### Rekombinante Expression des Norrins und die Herstellung von Antikörper ### 167 ### 4.5 ### Cornea-Vaskularisations-Assay ### 168 ### 4.6 ### Die Pathogenese des Norrie-Syndroms und die molekulare Wirkung des ### Norrie disease pseudoglioma-Gens/Proteins (�Norrins�) - Ein Ausblick ### 169 5 ZUSAMMENFASSUNG 173 6 SUMMARY 174 7 REFERENZEN 175 8 VERÖFFENTLICHUNGEN 184 ### 8.1 ### Wissenschaftliche Veröffentlichungen ### 184 ### 8.2 ### Kongressbeiträge ### 184 9 LEBENSLAUF 186 10 ANHANG 187 ### 10.1 ### Korrelation der Phänotypen mit Substitutionsmutationen im NDP-Gen ### 187 ### 10.2 ### In dieser Arbeit verwendete Primer ### 190 ### 10.3 ### Sequenz des Ndph-knockout-Transkripts ### 193# Zusammenfassung Das Norrie-Syndrom ist eine X-chromosomal rezessiv vererbte, kongenitale Blindheit, die mit Taubheit und geistiger Behinderung assoziiert sein kann. In dieser Arbeit sollten molekulare Pathogenesemechanismen dieses Syndroms am Ndph-knockout-Mausmodell aufgeklärt werden. Dabei wurden Expressionsanalysen aber auch histologische und proteinbiochemische Techniken für die Charakterisierung der betroffenen Organe, Auge und Gehirn, angewandt. Die Herstellung von cDNA-Subtraktionsbanken aus Augen (p21) und deren Charakterisierung mit Mikroarrays sowie Blot-Hybridisierungen führten nicht zur Identifizierung differentiell exprimierter Gene. Dies hängt möglicherweise mit geringen Unterschieden in der Genexpression in diesem frühen Entwicklungsstadium zusammen. Dennoch konnten wir mit quantitativer Real Time- RT-PCR zeigen, dass während der postnatalen Entwicklung der Retina viele Angiogenesefaktoren transkriptionell inhibiert oder stimuliert werden. Dadurch wurde nachgewiesen, dass Endothelzellen durch das Fehlen von Norrin in ihrer extrazellulären Umgebung initial betroffen sind und die Entwicklung der tiefen Kapillarnetzwerke in der inneren Retina blockiert wird. Dies führt zu einer Hypoxie (Sauerstoffmangel) ab p10, die hier als ein wesentlicher Pathogenesefaktor des Norrie-Syndroms identifiziert werden konnte. Diese Befunde können auch ähnliche Symptome bei familiärer exsudativer Vitreoretinopathie (FEVR), bei Morbus Coats und bei Frühgeborenenretinopathie (ROP) erklären. Globale Genexpressionsstudien im Gehirn des Mausmodells identifizierten eine reduzierte Wachstumshormonexpression. Diese trat nur im Gehirn und nicht in der Hypophyse auf, die das endokrinologisch wirksame Wachstumshormon (Gh) produziert. Die hirnspezifische Reduktion des Gh- Transkripts könnte eine mögliche Erklärung für die geistige Behinderung in Norrie-Patienten liefern, wobei der genaue molekulare Zusammenhang noch aufzuklären ist. Ein weiterer, neuer Befund war die Infertilität homozygoter Ndph-knockout-Weibchen. Als deren Ursache konnte eine gestörte Deziduaentwicklung ausgemacht werden. Um E7 verursachen mütterliche Einblutungen in die Dezidua den Verlust der Embryonen. Die hier nachgewiesene Expression von Ndph/NDP in Maus-Deziduae und humaner Plazenta weist auf eine wichtige Funktion des Gens in der weiblichen Reproduktion hin. Schließlich wurde rekombinantes Norrin hergestellt. Die damit gewonnen polyklonalen Antiseren erkannten das Antigen, detektierten aber in Gewebehomogenaten kein Norrin. Die funktionelle Charakterisierung des rekombinanten Norrins im Cornea-Vaskularisations�Assay erbrachte keinen Nachweis einer Funktion des Norrins in der Angiogenese. Insgesamt wiesen die hier gewonnenen Daten Angiogenesedefekte als wichtige Grundlage der Pathogenese des Norrie-Syndroms nach.# Summary Norrie disease (ND) is a rare X-linked recessive congenital blindness, sometimes associated with deafness and mental retardation. In this thesis the molecular pathogenic mechanisms of this syndrome should be elucidated using the Ndph knockout mouse model. Gene expression studies but also histology and protein biochemistry were used to characterize the affected organs, eye and brain. Gene expression analyses of eyes at p21 using cDNA subtraction in combination with microarrays and blot hybridization did not lead to the identification of differentially expressed genes. This might be due to low expression differences early on in the disease. However with quantitative Real Time RT-PCR we could show differential expression of many angiogenic factors during postnatal retinal development, suggesting an early effect of Norrin in the extracellular matrix on endothelial cells. Its lack leads to the block in the development of deep retinal capillary networks. Subsequently hypoxia develops after p10, which we could show to be an important pathogenic factor for Norrie disease. It is likely that it is also the molecular basis for similarities of the clinical Symptoms of the related diseases familial exudative vitreoretinopathie, coats disease and retinopathy of prematurity. Global gene expression studies in the brain of ND-mice identified a reduction of growth hormone expression. This reduction occurs specifically in the brain, but not in pituitary, where the endocrine active growth hormone (Gh) is produced. The brain-specific reduction of the Gh transcript might provide for the first time a possible explanation for the mental retardation in Norrie disease patients, although the molecular link remains to be elucidated. Also for the first time, the infertility of homozygous Ndph knockout female mice was found. The underlying cause was identified to be a disturbance in decidualization. Around E7 maternal bleedings into implantation sites have been discovered leading to loss of embryos by resorption. Additionally, the expression of Ndph/NDP in deciduae of mice and in human placenta also suggested an important function of this gene in female reproduction. In addition, recombinant Norrin was produced. The obtained polyclonal anti-sera detected the antigen but could not detect Norrin in tissue homogenates. The functional characterization of the recombinant Norrin in a cornea vascularization assay could not prove the role of Norrin in angiogenesis. Altogether the here obtained data suggested angiogenic defects as an important basis for pathogenesis in Norrie disease