Relación estructura-función de cirsina, una proteasa aspártica de <i>Cirsium vulgare</i>, y compuestos peptídicos derivados con actividad biológica

Las proteasas aspárticas típicas de plantas (o tipo pepsina) han sido escasamente estudiadas en comparación con sus contrapartes de origen no vegetal. Una excepción a esta afirmación, lo constituyen las cardosinas (Cynara cardunculus) usadas en la manufactura de quesos y la fitepsina (Hordeum vulgare), que al día de hoy continúa siendo una de las pocas proteasas de esta clase caracterizada estructuralmente y por tanto, el modelo utilizado en esta área. Una de las principales razones por las cuales las PAs de plantas no han sido objeto de mayor cantidad de estudios es su escasa abundancia natural. Ésto resulta especialmente cierto en el caso de sus precursores, los cuales contienen el llamativo dominio PSI (inserto específico de plantas), único entre las PAs. En un intento por identificar nuevas fuentes vegetales de PAs típicas, extractos de flores de varias especies pertenecientes a la familia Asteraceae que crecen en Argentina fueron probados en ensayos de coagulación de leche. Una de las especies que mostró esta capacidad coagulante sugiriendo por tanto la presencia de PAs, fue Cirsium vulgare -comúnmente conocido como cardo negro y considerada una maleza en los campos de nuestra región. Fundamentalmente debido a su amplia disponibilidad y a la ausencia de estudios reportados sobre sus PAs, se decidió emplear esta especie de la familia Asteraceae como material vegetal. En este contexto, el presente trabajo intenta generar un aporte al conocimiento de las PAs de origen vegetal mediante el estudio de procirsina, una proenzima de C. vulgare perteneciente a la familia A1, y del dominio PSI contenido en su secuencia.Facultad de Ciencias Exacta

Properties and applications of phytepsins from thistle flowers

Aqueous extracts of thistle flowers from the genus Cynara—Cardueae tribe Cass. (Cynareae Less.), Asteraceae Dumortier—are traditionally used in the Mediterranean region for production of artisanal cheeses. This is because of the presence of aspartic proteases (APs) with the ability to coagulate milk. Plant APs, collectively known as phytepsins (EC 3.4.23.40), are bilobed endopeptidases present in an ample variety of plant species with activity mainly at acidic pHs, and have two aspartic residues located on each side of a catalytic cleft that are responsible for catalysis. The cleavage of the scissile peptide-bond occurs primarily between residues with large hydrophobic side-chains. Even when aspartylendopeptidase activity in plants is normally present at relatively low levels overall, the flowers of several species of the Cardueae tribe possess APs with extremely high specific activities in certain tissues. For this reason, in the last two decades, APs present in thistle flowers have been the subject of intensive study. Present here is a compilation of work that summarizes the known chemical and biological properties of these proteases, as well as their biomedical and biotechnological applications.Centro de Investigación de Proteínas Vegetale

Biochemical characterization, cDNA cloning, and molecular modeling of araujiain aII, a papain-like cysteine protease from <i>Araujia angustifolia</i> latex

Araujiain aII, the protease with highest specific activity purified from latex of Araujia angustifolia (Apocynaceae), shows optimum proteolytic activity at alkaline pH, and it is completely inhibited by the irreversible inhibitor of cysteine proteases trans-epoxysucciny-l-leucyl-amido(4-guanidino) butane. It exhibits esterolytic activity on several N-α-Cbz-amino acid p-nitrophenyl esters with a preference for Gln, Ala, and Gly derivatives. Kinetic enzymatic assays were performed with the thiol proteinase substrate p-Glu-Phe-Leu-p-nitroanilide (Kₘ = 0.18 ± 0.03 mM, kcat = 1.078 ± 0.055 s⁻¹, kcat/Kₘ = 5.99 ± 0.57 s⁻¹ mM⁻¹). The enzyme has a pI value above 9.3 and a molecular mass of 23.528 kDa determined by mass spectrometry. cDNA of the peptidase was obtained by reverse transcription-PCR starting from total RNA isolated from latex. The deduced amino acid sequence was confirmed by peptide mass fingerprinting analysis. The N-terminus of the mature protein was determined by automated sequencing using Edman’s degradation and compared with the sequence deduced from cDNA. The full araujiain aII sequence was thus obtained with a total of 213 amino acid residues. The peptidase, as well as other Apocynaceae latex peptidases, is a member of the subfamily C1A of cysteine proteases. The enzyme belongs to the alpha + beta class of proteins, with two disulfide bridges (Cys22–Cys63 and Cys56–Cys95) in the alpha domain, and another one (Cys150–Cys201) in the beta domain, as was suggested by molecular modeling.Facultad de Ciencias ExactasCentro de Investigación de Proteínas Vegetale

Producción de factor de crecimiento epidermal humano recombinante biológicamente activo

El factor de crecimiento epidermal humano (hEGF) es un polipéptido de 53 aminoácidos que forma parte del complejo sistema de modulación del crecimiento y desarrollo celular. Cuando el EGF se une a su receptor (EGFR) en la superficie de las células, se produce la dimerización del EGFR seguida de la auto-fosforilación de residuos Tyr en los dominios citoplasmáticas del receptor. Los residuos Tyr fosforilados inician la cascada de eventos que conduce a la síntesis de ADN, ARN y proteínas. A través de la interacción con el EGFR, el EGF cumple una variedad de roles fisiológicos vinculados con el crecimiento celular, proliferación, diferenciación y supervivencia de diferentes tipos celulares.Facultad de Ciencias Médica

Producción de factor de crecimiento epidermal humano recombinante biológicamente activo

El factor de crecimiento epidermal humano (hEGF) es un polipéptido de 53 aminoácidos que forma parte del complejo sistema de modulación del crecimiento y desarrollo celular. Cuando el EGF se une a su receptor (EGFR) en la superficie de las células, se produce la dimerización del EGFR seguida de la auto-fosforilación de residuos Tyr en los dominios citoplasmáticas del receptor. Los residuos Tyr fosforilados inician la cascada de eventos que conduce a la síntesis de ADN, ARN y proteínas. A través de la interacción con el EGFR, el EGF cumple una variedad de roles fisiológicos vinculados con el crecimiento celular, proliferación, diferenciación y supervivencia de diferentes tipos celulares.Facultad de Ciencias Médica

Ghrelin proteolysis increases in plasma of men, but not women, with obesity

Aims: Since plasma ghrelin can undergo des-acylation and proteolysis, the aim of this study was to investigate the extent to which an enhancement of these reactions is associated to the decrease of ghrelin in plasma after food intake or in individuals with obesity. Main methods: we performed an intervention cross-sectional study, in which levels of ghrelin, desacyl-ghrelin (DAG), glucose, insulin, ghrelin des-acylation and ghrelin proteolysis were assessed in plasma before and after a test meal in 40 people (n = 21 males) with normal weight (NW, n = 20) or overweight/obesity (OW/OB, n = 20). Key findings: Preprandial ghrelin and DAG levels were lower, whereas preprandial ghrelin proteolysis was ∼4.6-fold higher in plasma of males with OW/OB. In males, ghrelin proteolysis positively correlated with glycemia. Ghrelin and DAG levels were also lower in females with OW/OB, but preprandial ghrelin proteolysis was not different between females with NW or OW/OB. Ghrelin and DAG levels decreased postprandially in males and females, independently of BMI, and ghrelin proteolysis increased postprandially ∼2 folds only in individuals with NW. Ghrelin des-acylation remained unaffected by BMI or feeding status in both sexes. Significance: Current study shows that ghrelin proteolysis increases in males with obesity as well as after meal in lean individuals. Therefore, ghrelin proteolysis may be an important checkpoint and, consequently, a putative pharmacological target to control circulating ghrelin levels in humans.Fil: Fittipaldi, Antonela Soledad. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Centro Científico Tecnológico Conicet - La Plata. Instituto Multidisciplinario de Biología Celular. Provincia de Buenos Aires. Gobernación. Comisión de Investigaciones Científicas. Instituto Multidisciplinario de Biología Celular. Universidad Nacional de La Plata. Instituto Multidisciplinario de Biología Celular; ArgentinaFil: Castrogiovanni, Daniel Cayetano. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Centro Científico Tecnológico Conicet - La Plata. Instituto Multidisciplinario de Biología Celular. Provincia de Buenos Aires. Gobernación. Comisión de Investigaciones Científicas. Instituto Multidisciplinario de Biología Celular. Universidad Nacional de La Plata. Instituto Multidisciplinario de Biología Celular; ArgentinaFil: Lufrano, Daniela. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Centro Científico Tecnológico Conicet - La Plata. Instituto Multidisciplinario de Biología Celular. Provincia de Buenos Aires. Gobernación. Comisión de Investigaciones Científicas. Instituto Multidisciplinario de Biología Celular. Universidad Nacional de La Plata. Instituto Multidisciplinario de Biología Celular; ArgentinaFil: Saenz, Camila. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Centro Científico Tecnológico Conicet - La Plata. Instituto Multidisciplinario de Biología Celular. Provincia de Buenos Aires. Gobernación. Comisión de Investigaciones Científicas. Instituto Multidisciplinario de Biología Celular. Universidad Nacional de La Plata. Instituto Multidisciplinario de Biología Celular; ArgentinaFil: de Francesco, Pablo Nicolás. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Centro Científico Tecnológico Conicet - La Plata. Instituto Multidisciplinario de Biología Celular. Provincia de Buenos Aires. Gobernación. Comisión de Investigaciones Científicas. Instituto Multidisciplinario de Biología Celular. Universidad Nacional de La Plata. Instituto Multidisciplinario de Biología Celular; ArgentinaFil: Lalonde, Tyler. Western University; CanadáFil: Luyt, Leonard G.. Western University; CanadáFil: Cantel, Sonia. Université Montpellier II; FranciaFil: Fehrentz, Jean Alain. Université Montpellier II; FranciaFil: Andreoli, Maria Florencia. Provincia de Buenos Aires. Ministerio de Salud. Hospital de Niños "Sor María Ludovica" de La Plata. Instituto de Desarrollo e Investigaciones Pediátricas; Argentina. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Centro Científico Tecnológico Conicet - La Plata; ArgentinaFil: Perello, Mario. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Centro Científico Tecnológico Conicet - La Plata. Instituto Multidisciplinario de Biología Celular. Provincia de Buenos Aires. Gobernación. Comisión de Investigaciones Científicas. Instituto Multidisciplinario de Biología Celular. Universidad Nacional de La Plata. Instituto Multidisciplinario de Biología Celular; Argentin

Plasma levels of ghrelin, des-acyl ghrelin and LEAP2 in children with obesity: Correlation with age and insulin resistance

Objective: The octanoylated peptide hormone ghrelin regulates appetite and glycaemic control. Des-acyl ghrelin abolishes some effects of ghrelin, but does not bind to ghrelin receptor. LEAP2 is a novel ligand for ghrelin receptor that blocks the effects of ghrelin. Some evidences show that plasma levels of these peptides are altered adults with obesity, but their levels in childhood obesity remain poorly studied. Therefore, the objective of this study was to assess fasting plasma levels of ghrelin, des-acyl ghrelin and LEAP2 in children with normoweight, overweight/obesity and their association with different anthropometric and metabolic variables. Design: A total of 42 females and 40 males, ages 3-12 years-old were enrolled as a cross-sectional cohort. Results: Plasma levels of des-acyl ghrelin and LEAP2 (but not ghrelin) were lower and ghrelin/des-acyl ghrelin ratio was higher in children with overweight/obesity. Des-acyl ghrelin negatively correlated with age, BMI z-score, insulin and HOMA index, and the correlations were stronger in children with overweight/obesity. LEAP2 levels negatively correlated with BMI z-score. No gender differences were found. Conclusions: Our findings suggest that ghrelin tone is increased in childhood obesity, due to a decrease on plasma levels of des-acyl ghrelin and LEAP2, and that des-acyl ghrelin is associated to insulin resistance, particularly in children with overweight/obesity.Fil: Fittipaldi, Antonela Soledad. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Centro Científico Tecnológico Conicet - La Plata. Instituto Multidisciplinario de Biología Celular. Provincia de Buenos Aires. Gobernación. Comisión de Investigaciones Científicas. Instituto Multidisciplinario de Biología Celular. Universidad Nacional de La Plata. Instituto Multidisciplinario de Biología Celular; ArgentinaFil: Hernandez, Julieta. Provincia de Buenos Aires. Ministerio de Salud. Hospital de Niños "Sor María Ludovica" de La Plata. Instituto de Desarrollo e Investigaciones Pediátricas; ArgentinaFil: Castrogiovanni, Daniel Cayetano. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Centro Científico Tecnológico Conicet - La Plata. Instituto Multidisciplinario de Biología Celular. Provincia de Buenos Aires. Gobernación. Comisión de Investigaciones Científicas. Instituto Multidisciplinario de Biología Celular. Universidad Nacional de La Plata. Instituto Multidisciplinario de Biología Celular; ArgentinaFil: Lufrano, Daniela. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Centro Científico Tecnológico Conicet - La Plata. Instituto Multidisciplinario de Biología Celular. Provincia de Buenos Aires. Gobernación. Comisión de Investigaciones Científicas. Instituto Multidisciplinario de Biología Celular. Universidad Nacional de La Plata. Instituto Multidisciplinario de Biología Celular; ArgentinaFil: de Francesco, Pablo Nicolás. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Centro Científico Tecnológico Conicet - La Plata. Instituto Multidisciplinario de Biología Celular. Provincia de Buenos Aires. Gobernación. Comisión de Investigaciones Científicas. Instituto Multidisciplinario de Biología Celular. Universidad Nacional de La Plata. Instituto Multidisciplinario de Biología Celular; ArgentinaFil: Garrido, Verónica. Provincia de Buenos Aires. Ministerio de Salud. Hospital de Niños "Sor María Ludovica" de La Plata. Instituto de Desarrollo e Investigaciones Pediátricas; ArgentinaFil: Vitaux, Patrick. Bertin Technologies; FranciaFil: Fasano, María Victoria. Universidad Nacional de La Plata. Facultad de Ciencias Exactas. Departamento de Matemáticas; Argentina. Provincia de Buenos Aires. Ministerio de Salud. Hospital de Niños "Sor María Ludovica" de La Plata. Instituto de Desarrollo e Investigaciones Pediátricas; ArgentinaFil: Fehrentz, Jean Alain. Bertin Technologies; Francia. Université Montpellier II; FranciaFil: Fernández, Adriana. Provincia de Buenos Aires. Ministerio de Salud. Hospital de Niños "Sor María Ludovica" de La Plata. Instituto de Desarrollo e Investigaciones Pediátricas; ArgentinaFil: Andreoli, María F.. Provincia de Buenos Aires. Ministerio de Salud. Hospital de Niños "Sor María Ludovica" de La Plata. Instituto de Desarrollo e Investigaciones Pediátricas; Argentina. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas; ArgentinaFil: Perello, Mario. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Centro Científico Tecnológico Conicet - La Plata. Instituto Multidisciplinario de Biología Celular. Provincia de Buenos Aires. Gobernación. Comisión de Investigaciones Científicas. Instituto Multidisciplinario de Biología Celular. Universidad Nacional de La Plata. Instituto Multidisciplinario de Biología Celular; Argentin

Molecular cloning and characterization of procirsin, an active aspartic protease precursor from <i>Cirsium vulgare</i> (Asteraceae)

Typical aspartic proteinases from plants of the Astereaceae family like cardosins and cyprosins are wellknown milk-clotting enzymes. Their effectiveness in cheesemaking has encouraged several studies on other Astereaceae plant species for identification of new vegetable rennets. Here we report on the cloning, expression and characterization of a novel aspartic proteinase precursor from the flowers of Cirsium vulgare (Savi) Ten. The isolated cDNA encoded a protein product with 509 amino acids, termed cirsin, with the characteristic primary structure organization of plant typical aspartic proteinases. The pro form of cirsin was expressed in Escherichia coli and shown to be active without autocatalytically cleaving its pro domain. This contrasts with the acid-triggered autoactivation by pro-segment removal described for several recombinant plant typical aspartic proteinases. Recombinant procirsin displayed all typical proteolytic features of aspartic proteinases as optimum acidic pH, inhibition by pepstatin, cleavage between hydrophobic amino acids and strict dependence on two catalytic Asp residues for activity. Procirsin also displayed a high specificity towards j-casein and milk-clotting activity, suggesting it might be an effective vegetable rennet. The findings herein described provide additional evidences for the existence of different structural arrangements among plant typical aspartic proteinases.Centro de Investigación de Proteínas Vegetale

Informe científico de investigador: Lufrano, Daniela (2016-2017)

Ghrelina (Ghr) es una hormona peptídica de 28 aminoácidos sintetizada mayoritariamente en el estómago y que se encuentra acilada en su tercer residuo. A nivel del sistema nervioso central, Ghr se une al receptor específico GHSR estimulando el apetito y la preferencia por alimentos calóricos. A pesar de ser susceptible a la acción de proteasas, la proteólisis de Ghr y la presencia de fragmentos peptídicos derivados de la hormona (variantes moleculares) en circulación, no está explorada. Así, la tarea que desarrollo se centra en el estudio de la proteólisis de Ghr como posible mecanismo de generación de variantes moleculares con bioactividad diferencial respecto a la hormona entera, con el objetivo de ampliar el conocimiento de la biología de Ghr así como también obtener una correlación cuali-cuantitativa entre dichas variantes y desordenes alimentarios (obesidad, anorexia nervosa, bulimina) a fin de orientar al diagnóstico, pronóstico y tratamiento de estas patologías

Acción de peptidasas aspárticas de flores de <i>Carduus acanthoides</i> y <i>Carduus thoermeri</i> sobre caseinatos bovino y caprino

Extractos crudos de flores del género Cynara L. pertenecientes a la familia Asteraceae (C. cardunculus, C. humilis y C. scolymus) se utilizan tradicionalmente en la península ibérica como coagulantes de leche en la manufactura de quesos. Esta propiedad es debida a la presencia de proteasas aspárticas. Los objetivos de este trabajo fueron: a) la obtención de preparaciones enzimáticas crudas con actividad coagulante de leche a partir de flores de Carduus acanthoides L. y Carduus thoermeri Weinm., pertenecientes a la familia Asteraceae y b) la obtención de hidrolizados de caseínas bovina y caprina con dichos extractos. Se obtuvieron extractos crudos (EC) de flores de C. acanthoides y C. thoermeri por trituración con nitrógeno líquido y extracción con buffers de pH 3,0 y 6,0. Se evaluó la actividad coagulante de los mismos sobre leche bovina siguiendo el procedimiento descrito por la IDF (Internacional Dairy Federation). La mezcla de reacción conteniendo extracto crudo y leche al 12% en cloruro de calcio 10 mM en proporción 1 a 10 se incubó a 30ºC. Se evaluó el efecto de inhibidores específicos de grupo preincubando los extractivos con E-64, pepstatina A y PMSF midiendo la actividad coagulante remanente.Centro de Investigación de Proteínas Vegetale