TRIAGEM NEONATAL DE IMUNODEFICIÊNCIAS GRAVES COMBINADAS POR MEIO DE TRECS E KRECS: SEGUNDO ESTUDO PILOTO NO BRASIL

RESUMO Objetivo: Validar a quantificação de T-cell receptor excision circles (TRECs) e kappa-deleting recombination circles (KRECs) por reação em cadeia de polimerase (polymerase chain reaction, PCR) em tempo real (qRT-PCR), para triagem neonatal de imunodeficiências primárias que cursam com defeitos nas células T e/ou B no Brasil. Métodos: Amostras de sangue de recém-nascidos (RN) e controles foram coletadas em papel-filtro. O DNA foi extraído e os TRECs e KRECs foram quantificados por reação duplex de qRT-PCR. O valor de corte foi determinado pela análise de Receiver Operating Characteristics Curve, utilizando-se o programa Statistical Package for the Social Sciences (SSPS) (IBM®, Armonk, NY, EUA). Resultados: 6.881 amostras de RN foram analisadas quanto à concentração de TRECs e KRECs. Os valores de TRECs variaram entre 1 e 1.006 TRECs/µL, com média e mediana de 160 e 139 TRECs/µL, respectivamente. Três amostras de pacientes diagnosticados com imunodeficiência grave combinada (severe combined immunodeficiency, SCID) apresentaram valores de TRECs abaixo de 4/µL e um paciente com Síndrome de DiGeorge apresentou TRECs indetectáveis. Os valores de KRECs encontraram-se entre 10 e 1.097 KRECs/µL, com média e mediana de 130 e 108 KRECs/µL, e quatro pacientes com diagnóstico de agamaglobulinemia tiveram resultados abaixo de 4 KRECs/µL. Os valores de corte encontrados foram 15 TRECs/µL e 14 KRECs/µL, e foram estabelecidos de acordo com a análise da Receiver Operating Characteristics Curve, com sensibilidade de 100% para detecção de SCID e agamaglobulinemia, respectivamente. Conclusões: A quantificação de TRECs e KRECs foi capaz de diagnosticar crianças com linfopenias T e/ou B em nosso estudo, validando a técnica e dando o primeiro passo para a implementação da triagem neonatal em grande escala no Brasil

Genetic and immunologic factors related to Congenital Zika Syndrome in humans

O zika vírus é um flavivírus que reemergiu nas Américas em 2015 e se tornou um problema de saúde pública internacional. O aumento na prevalência de infecções pelo zika no Brasil coincidiu com o aumento da ocorrência de casos de microcefalia e outras complicações neurológicas em neonatos, cunhando a Síndrome Congênita do Zika. Apesar da gravidade de certos casos, acredita-se que apenas 20% dos infectados manifestem quaisquer sintomas da doença, adicionando-se a isso amplo espectro clínico. Estudos com modelos animais mostraram que apenas linhagens com deficiências em componentes da via de interferon do tipo I são susceptíveis aos danos neurológicos congênitos. Isso, somado a estudos com gêmeos dizigóticos com fenótipos discordantes para a síndrome,sugerem que fatores genéticos da imunidade inata do hospedeiro podem ter papel determinante no curso da infecção e do estabelecimento da síndrome. Sendo assim, o presente estudovisou investigar os mecanismos genéticos do desenvolvimento da Síndrome Congênita do Zika em humanos,com especial foco na resposta imunológica antiviral. Para isso, foram incluídas no estudo mulheres infectadas pelo vírus durante a gestação e também os respectivos filhos, com desenvolvimento normal ou com a Síndrome Congênita do Zika. A investigação genética iniciou através do sequenciamento completo de exoma de 75 indivíduos, divididos em dois grupos: um composto por 20 mães expostas e 21 crianças afetadas e o segundo composto por 14 mães expostas e 20 crianças saudáveis. Foram selecionadas para análise primária variantes raras e com predição de patogenicidade por ferramentas in silicoem genes associados aos erros inatos da imunidade.Adicionalmente, foi realizada analise exploratória de associação de variantes comuns e raras ao fenótipo da SCZ em quaisquer genes. Não houve evidência para apontar mecanismo causal, contudo foram identificadas variantes em genes que levam a fenótipos sindrômicos associados a defeitos neurológicos (KMT2A, KMT2D, RTEL1 e NFE2L2 em genes que codificam proteínas que interagem com componentes da imunidade antiviral (RELA, TNFAIP3) e genes associados ao fenótipo da síndrome congênita que sãopreferencialmente expressos no cérebro (CNTNAP3,FOXD4L6 ) .Todos esses podem ser fatores genéticos modificadores que contribuem individualmente em pequena escala para a severidade do fenótipo dos indivíduos afetados e também pode indicar não há um único gene ou mecanismo capaz de levar à SCZ, mas sim, uma multiplicidade de fatores que podem contribuir para o desfecho final.Zika virus is a flavivirus that re-emerged in the Americas in 2015 and has become an international public health problem. The increase in the prevalence of Zika infections in Brazil coincided with the increase in the occurrence of cases of microcephaly and other neurological complications in neonates, coining the Congenital Zika Syndrome. Despite the severity of certain cases, it is believed that only 20% of those infected children, manifest any symptoms of the disease, which presents with a broad clinical spectrum. Studies with animal models have shown that only strains with deficiencies in components of the type I interferon pathway are susceptible to congenital neurological damage. This, added to studies with dizygotic twins with discordant phenotypes for the syndrome, suggest that genetic factors of the host\'s innate immunity may play a decisive role in the course of the infection and the establishment of the syndrome. Therefore, the present study aimed to investigate the genetic mechanisms of the development of Congenital Zika Syndrome in humans, with special focus on the antiviral immune response. For this purpose, women infected by the virus during pregnancy and their children, with normal development or with Congenital Zika Syndrome, were included in the study. The genetic investigation started with the whole exome sequencing of 75 individuals, divided into two groups: one composed of 20 exposed mothers and 21 affected children and the second composed of 14 exposed mothers and 20 healthy children. Rare variants with prediction of pathogenicity by in silico tools in genes associated with inborn errors of immunity were selected for the primary analysis. Additionally, an exploratory analysis of the association of common and rare variants with the SCZ phenotype was performed, encompassing the whole exome. There was no evidence to pinpoint a causal mechanism, however variants were identified in genes that lead to syndromic phenotypes associated with neurological defects (KMT2A, KMT2D, RTEL1 and NFE2L2 ), genes that encode proteins that interact with components of antiviral immunity (RELA, TNFAIP3 ) and genes associated with the congenital syndrome phenotype that are preferentially expressed in the brain (CNTNAP3, FOXD4L6 ). All of these may be genetic modifying factors that contribute individually on a small scale to the worsening of the phenotype of affected individuals and may also indicate that this is not a single gene or mechanism leading to SCZ, but a multiplicity of factors that may contribute to the final outcome

Genetic and molecular investigation of patients with Severe Combined Immunodeficiency,

A imunodeficiência combinada grave (SCID) é uma doença caracterizada por profunda deficiência de células T, que afeta as imunidades celular e humoral e gera anormalidades graves no desenvolvimento e funções do sistema imune. Recém-nascidos com SCID apresentam a doença nos primeiros meses de vida e tem grande susceptibilidade a infecções. Sem tratamento, essas condições são invariavelmente fatais, porém se reconhecidas precocemente, há a possibilidade da realização do transplante de células-tronco hematopoiéticas, o tratamento curativo, o que torna a SCID uma emergência pediátrica. A investigação do defeito genético é uma prerrogativa para o condicionamento adequado do transplante, a terapia gênica, o aconselhamento genético e o diagnóstico pré-natal. No Brasil, o conhecimento sobre SCID é incipiente e não existem dados moleculares sobre pacientes com a doença. Sendo assim, este estudo teve por objetivo investigar defeitos genético-moleculares de pacientes brasileiros com SCID. Foram incluídos 13 pacientes, todos com início precoce dos sintomas e manifestações clínicas esperadas em SCID (principalmente infecções respiratórias, de pele, diarreia crônica e atraso de crescimento). Os patógenos isolados foram vírus, bactérias e fungos oportunistas comumente encontrados em pacientes SCID. A partir da quantificação de TRECS e KRECs e imunofenotipagem de linfócitos, foi montado o perfil imunológico de cada paciente, que guiou o sequenciamento direto de Sangerdos genes mais frequentemente mutados em cada imunofenótipo de SCID. Mutações em 3 pacientes foram identificadas por Sanger e, posteriormente, 8 pacientes cujas mutações não foram encontradas no Sanger foram encaminhados para o sequenciamento completo de exoma, que resultou na identificação do gene afetado em 62,5% dos casos. Ao todo, foram identificadas mutações patogênicas em 8 dos 13 pacientes. Os resultados revelaram 6 alterações em 5 genes de SCID clássica (IL7R, RAG2, DCLRE1C, JAK3, IL2RG), 1 mutação no gene CD3G e 2 alterações em CECR1. Das 9 mutações encontradas, 5 não possuíam registro na literatura. O estudo genético de SCID em nosso país é problemático, principalmente porque ainda hoje, a esmagadora maioria dos pacientes não é diagnosticada. A implementação da quantificação de TRECs e KRECs como triagem neonatal para linfopenias graves é uma ferramenta fundamental para que os pacientes SCID possam ser identificados, investigados e tratados adequadamente.Primary immunodeficiencies are a heterogeneous group of genetic diseases that lead to increased susceptibility to infections and affect mostly children. Severe Combined Immunodeficiency (SCID) is the most severe of all these diseases and is characterized by profound T cell deficiency, which affects cellular and humoral immunities and leads to severe abnormalities in the development and function of the immune system. Newborns with SCID present the disease in the first months of life and are highly susceptible to infections. Without treatment, these conditions are invariably fatal, but if recognized early, there is the possibility of hematopoietic stem cell transplantation, the curative treatment, which makes SCID a pediatric emergency. Identifying the genetic defect of SCID patients is a prerequisite for proper transplant conditioning, gene therapy, genetic counseling and prenatal diagnosis. Knowledge about SCID is still incipient in Brazil, and there are virtually no molecular data on patients with the disease. Therefore, this study aimed to investigate genetic-molecular defects of Brazilian patients with SCID. Thirteen patients were recruited, all with early onset of symptoms and clinical manifestations expected of classic SCIDs (mainly respiratory and skin infections, chronic diarrhea and failure to thrive). The pathogens isolated were opportunistic viruses, bacteria and fungi often reported in SCID patients. The immunological profile from each patient was defined by the quantification of TRECS and KRECs and lymphocyte immunophenotyping, which was meant to guide direct sequencing by Sanger of the most frequently mutated genes of each SCID immunophenotype. Mutations in 3 patients were identified by Sanger and, subsequently, 8 patients whose mutations were not identified by Sanger were referred for whole exome sequencing, which resulted in the identification of the affected gene in 62,5% of cases. Pathogenic mutations were identified in 8 of the 13 patients. The results revealed 6 mutations in 5 genes associated to classical SCID genes (IL7R, RAG2, DCLRE1C, JAK3, IL2RG), 1 mutation in the CD3G gene, and 2 mutations in CECR1. Five of the 9 mutations found had no record in the literature. SCID genetic investigation in our country is troublesome, mainly because even nowadays, the vast majority of patients are not diagnosed properly. Newborn screening for SCID and other severe lymphopenias by the quantification of TRECs and KRECs is key for the identification, investigation and proper treatment of SCID patients

Neonatal screening for severe combined immunodeficiency in Brazil,

Abstract Objective To apply, in Brazil, the T-cell receptor excision circles (TRECs) quantification technique using real-time polymerase chain reaction in newborn screening for severe combined immunodeficiency and assess the feasibility of implementing it on a large scale in Brazil. Methods 8715 newborn blood samples were collected on filter paper and, after DNA elution, TRECs were quantified by real-time polymerase chain reaction. The cutoff value to determine whether a sample was abnormal was determined by ROC curve analysis, using SSPS. Results The concentration of TRECs in 8,682 samples ranged from 2 to 2,181 TRECs/µL of blood, with mean and median of 324 and 259 TRECs/µL, respectively. Forty-nine (0.56%) samples were below the cutoff (30 TRECs/µL) and were reanalyzed. Four (0.05%) samples had abnormal results (between 16 and 29 TRECs/µL). Samples from patients previously identified as having severe combined immunodeficiency or DiGeorge syndrome were used to validate the assay and all of them showed TRECs below the cutoff. Preterm infants had lower levels of TRECs than full-term neonates. The ROC curve showed a cutoff of 26 TRECs/µL, with 100% sensitivity for detecting severe combined immunodeficiency. Using this value, retest and referral rates were 0.43% (37 samples) and 0.03% (3 samples), respectively. Conclusion The technique is reliable and can be applied on a large scale after the training of technical teams throughout Brazil

TRIAGEM NEONATAL DE IMUNODEFICIÊNCIAS GRAVES COMBINADAS POR MEIO DE TRECS E KRECS: SEGUNDO ESTUDO PILOTO NO BRASIL

RESUMO Objetivo: Validar a quantificação de T-cell receptor excision circles (TRECs) e kappa-deleting recombination circles (KRECs) por reação em cadeia de polimerase (polymerase chain reaction, PCR) em tempo real (qRT-PCR), para triagem neonatal de imunodeficiências primárias que cursam com defeitos nas células T e/ou B no Brasil. Métodos: Amostras de sangue de recém-nascidos (RN) e controles foram coletadas em papel-filtro. O DNA foi extraído e os TRECs e KRECs foram quantificados por reação duplex de qRT-PCR. O valor de corte foi determinado pela análise de Receiver Operating Characteristics Curve, utilizando-se o programa Statistical Package for the Social Sciences (SSPS) (IBM®, Armonk, NY, EUA). Resultados: 6.881 amostras de RN foram analisadas quanto à concentração de TRECs e KRECs. Os valores de TRECs variaram entre 1 e 1.006 TRECs/µL, com média e mediana de 160 e 139 TRECs/µL, respectivamente. Três amostras de pacientes diagnosticados com imunodeficiência grave combinada (severe combined immunodeficiency, SCID) apresentaram valores de TRECs abaixo de 4/µL e um paciente com Síndrome de DiGeorge apresentou TRECs indetectáveis. Os valores de KRECs encontraram-se entre 10 e 1.097 KRECs/µL, com média e mediana de 130 e 108 KRECs/µL, e quatro pacientes com diagnóstico de agamaglobulinemia tiveram resultados abaixo de 4 KRECs/µL. Os valores de corte encontrados foram 15 TRECs/µL e 14 KRECs/µL, e foram estabelecidos de acordo com a análise da Receiver Operating Characteristics Curve, com sensibilidade de 100% para detecção de SCID e agamaglobulinemia, respectivamente. Conclusões: A quantificação de TRECs e KRECs foi capaz de diagnosticar crianças com linfopenias T e/ou B em nosso estudo, validando a técnica e dando o primeiro passo para a implementação da triagem neonatal em grande escala no Brasil