Nonclassical roles for IFN-γand IL-10 in a murine model of immunoedition

Aims: to characterize, by means of univariate and multivariate approaches, the Th1 and Th2 responses during the different phases of tumor immunoediting. Materials & Methods: we used a multivariate principal component analysis applied to analyze the joint behavior of serum concentrations of IFN-γ, IL-2, IL-10 and IL-4, during the different phases of tumor immunoediting, in CBi/L mice challenged with M-406 mammary adenocarcinoma. Results & Conclusions: Animals in equilibrium phase showed the widest variations in values of the four cytokines. In this experimental model the role of IFN-γ would be related to tumor growth and progression, while IL-10 would participate in the antitumor immune response. Lay abstract: Breast cancer is a complex, multifactor disease that affects about 10% of women in industrialized countries. The immune system has the ability to monitor the appearance of tumors, but the tumors have the ability to escape such rejection. For this reason, in order to design different therapeutic strategies, it is important to know the different mechanisms that take place when a tumor grows or when it is rejected. Here we sought to elucidate some of these mechanismsFil: del Giúdice, Antonela. Universidad Nacional de Rosario. Facultad de Ciencias Medicas. Instituto de Genética Experimental; Argentina. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Centro Científico Tecnológico Conicet - Rosario; ArgentinaFil: Pagura, Lucas. Universidad Nacional de Rosario. Facultad de Ciencias Medicas. Instituto de Genética Experimental; Argentina. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Centro Científico Tecnológico Conicet - Rosario; ArgentinaFil: Capitani, María Celeste. Universidad Nacional de Rosario. Facultad de Ciencias Medicas. Instituto de Genética Experimental; ArgentinaFil: Mainetti, Leandro Ernesto. Universidad Nacional de Rosario. Facultad de Ciencias Medicas. Instituto de Genética Experimental; Argentina. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Centro Científico Tecnológico Conicet - Rosario; ArgentinaFil: Scharovsky, Olga Graciela. Universidad Nacional de Rosario. Facultad de Ciencias Medicas. Instituto de Genética Experimental; Argentina. Universidad Nacional de Rosario. Consejo de Investigaciones de la Universidad de Rosario; Argentina. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Centro Científico Tecnológico Conicet - Rosario; ArgentinaFil: Di Masso, Ricardo Jose. Universidad Nacional de Rosario. Facultad de Ciencias Medicas. Instituto de Genética Experimental; Argentina. Universidad Nacional de Rosario. Consejo de Investigaciones de la Universidad de Rosario; ArgentinaFil: Rico, Maria Jose. Universidad Nacional de Rosario. Facultad de Ciencias Medicas. Instituto de Genética Experimental; Argentina. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Centro Científico Tecnológico Conicet - Rosario; ArgentinaFil: Rozados, Viviana Rosa. Universidad Nacional de Rosario. Facultad de Ciencias Medicas. Instituto de Genética Experimental; Argentina. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Centro Científico Tecnológico Conicet - Rosario; Argentin

Caracterización de la proteína TcHTE y su relación con el transporte de hemo en Trypanosoma cruzi

Trypanosoma cruzi, el agente causante de la enfermedad de Chagas-Mazza, carece de las enzimas de la vía de síntesis de hemo que está altamente conservada a los largo de la evolución, dando origen a la auxotrofía por esta molécula esencial para los organismos aeróbicos [Koreny, et al., 2010 - Panek y O'Brian, 2002]. Debido a esta deficiencia, T. cruzi debe incorporar este cofactor ya sea del hospedador mamífero o del insecto vector y al mismo tiempo controlar su distribución y concentración intracelular para evitar su toxicidad [Koreny, et al., 2010]. Debido a sus características hidrofóbicas, la carga del ión central y su tamaño, el hemo no podría atravesar libremente las membranas biológicas, por lo que se ha propuesto que deben existir transportadores proteicos dedicados a esta función [Cupello, et al., 2011 - Lara, et al., 2007] que le permitirían al parásito incorporar suficiente hemo para completar su cuota. Si bien se han descripto y caracterizado diversos mecanismos de incorporación de hemo en organismos procariotas [Anzaldi y Skaar, 2010], los mecanismos de transporte en organismos eucariotas no han sido caracterizados en su totalidad, y particularmente en tripanosomátidos, se desconocen cuáles son las proteínas involucradas y cómo funcionan. En este trabajo de tesis nos propusimos entonces, estudiar el proceso de importación del cofactor hemo en los diferentes estadios del ciclo de vida de Trypanosoma cruzi, analizando su regulación y procurando la identificación de proteínas que cumplan su función en alguna de estas etapas del transporte. Los resultados obtenidos han permitido profundizar el conocimiento general sobre el transporte de hemo en T. cruzi. Hemos avanzado en el estudio de la relación entre el hemo y el estadio de epimastigote analizando los efectos causados por los cambios en la disponibilidad de este cofactor sobre el parásito. Además, mediante la utilización de análogos fluorescentes de hemo (AHs) se logró determinar que el transporte de hemo ocurría solo en los estadios replicativos del parásito. Por otro lado, hemos identificado en el genoma de T. cruzi, una secuencia codificante para una proteína de la familia HRG (debido a su nombre en inglés Heme Responsive Genes), a la cual denominamos TcHTE. Mediante ensayos de complementación heteróloga comprobamos que esta proteína facilita el transporte de hemo en levaduras (de allí su nombre TcHTE por Heme Transport Enhancer) [Merli, et al., 2016]. Además, la expresión de la proteína recombinante como fusión a la proteína verde fluorescente en su extremo C-terminal (TcHTE-HIS-GFP) permitió identificar su localización en la membrana plasmática de las levaduras). En el parásito, la expresión de la proteína recombinante, nos permitió determinar que en epimastigotes y tripomastigotes, la proteína se localiza en la región del bolsillo flagelar [Merli, et al., 2016], mientras que en amastigotes la proteína recombinante se encontraría mayoritariamente en la región del bolsillo flagelar pero también pudo ser detectada en la membrana plasmática. Por otro lado, hemos comprobado que la expresión de la proteína recombinante en epimastigotes favorece la incorporación del cofactor hemo. Hemos diseñado y obtenido anticuerpos policlonales de conejo que reconocen específicamente a TcHTE, los cuales fueron utilizados en distintas técnicas (como Western Blot (WB), Inmunofluorescencia Indirecta (IFI)) para analizar la acumulación de la proteína endógena en los diferentes estadios del ciclo celular del parásito, y su relación con la importación de hemo. Estos estudios fueron completados con el análisis de los niveles de transcripto de TcHTE, dando resultados concordantes. Tanto la acumulación de la proteína como los niveles de transcripto fueron más abundantes en los estadios replicativos del parásito siendo casi indetectables en el estadio de tripomastigote. Además, en epimastigotes determinamos que tanto la acumulación de la proteína como los niveles de transcripto, varían según la presencia de hemina en el medio de cultivo. A su vez, la utilización de los AHs nos permitió demostrar que el parásito regularía la expresión de la proteína TcHTE en función de la concentración intracelular de porfirinas (hemo y AHs). Mediante diversas técnicas de microscopía, y la utilización de la proteína recombinante TcHTE-HIS-GFP, fuimos capaces de comprobar que el extremo C-terminal se encuentra localizado del lado citosólico de la célula (tanto en el parásito, como en células HEK293-T), tal como había sido predicho para las proteínas de la familia HRG [Huynh, et al., 2012 - Rajagopal, et al., 2008 - Yuan, et al., 2012], siendo la primera vez que se comprueba experimentalmente. Además, los resultados que obtuvimos mediante TIRF-M indican que la proteína se encontraría formando multímeros (trímeros) en la superficie celular, lo que fortalece la hipótesis de que TcHTE forme parte del sistema responsable del transporte de hemo en T. cruzi. En función de los resultados obtenidos, podemos concluir que T. cruzi solo incorpora hemo en los estadios replicativos, mediante la expresión de un complejo proteico en el bolsillo flagelar, que involucraría la participación de trímeros de TcHTE. Si bien la regulación de la expresión del complejo es incierta, ésta respondería a la concentración y disponibilidad de hemo intracelular, permitiendo la incorporación del cofactor solo cuando es necesario, evitando así los efectos tóxicos de un exceso de hemo libre. Completar la elucidación de esta vía, identificando otras proteínas que participen en el proceso, y estableciendo los mecanismos de regulación, permitirían identificar nuevos blancos moleculares que puedan ser utilizados como estrategias para la inhibición de la proliferación de T. cruzi.Fil: Pagura, Lucas. Universidad Nacional de Rosario. Facultad de Ciencias Bioquímicas y Farmacéuticas. Instituto de Biología Molecular y Celular de Rosario (IBR-CONICET); Argentina

A new model for Trypanosoma cruzi heme homeostasis depends on modulation of TcHTE protein expression

Heme is an essential cofactor for many biological processes in aerobic organisms, which can synthesize it de novo through a conserved pathway. Trypanosoma cruzi, the etiological agent of Chagas disease, as well as other trypanosomatids relevant to human health, are heme auxotrophs, meaning they must import it from their mammalian hosts or insect vectors. However, how these species import and regulate heme levels is not fully defined yet. It is known that the membrane protein TcHTE is involved in T. cruzi heme transport, although its specific role remains unclear. In the present work, we studied endogenous TcHTE in the different life cycle stages of the parasite to gain insight into its function in heme transport and homeostasis. We have confirmed that TcHTE is predominantly detected in repli cative stages (epimastigote and amastigote), in which heme transport activity was previously validated. We also showed that in epimastigotes, TcHTE protein and mRNA levels decrease in response to increments in heme concentration, confirming it as a member of the heme response gene family. Finally, we demon strated that T. cruzi epimastigotes can sense intracellular heme by an unknown mechanism and regulate heme transport to adapt to changing conditions. Based on these results, we pro pose a model in which T. cruzi senses intracellular heme and regulates heme transport activity by adjusting the expression of TcHTE. The elucidation and characterization of heme transport and homeostasis will contribute to a better understanding of a critical pathway for T. cruzi biology allowing the identification of novel and essential proteins.This is a post-peer-review, pre-copyedit version of an article published in Journal of Biological Chemistry (JBC). The final authenticated version is available online at: https://doi.org/10.1074/jbc.ra120.014574Fil: Pagura, Lucas. Universidad Nacional de Rosario. Facultad de Ciencias Bioquímicas y Farmacéuticas. Instituto de Biología Molecular y Celular de Rosario (IBR -CONICET); Argentina.Fil: Tevere, Evelyn. Universidad Nacional de Rosario. Facultad de Ciencias Bioquímicas y Farmacéuticas. Instituto de Biología Molecular y Celular de Rosario (IBR -CONICET); Argentina.Fil: Merli, Marcelo Luciano. Universidad Nacional de Rosario. Facultad de Ciencias Bioquímicas y Farmacéuticas. Instituto de Biología Molecular y Celular de Rosario (IBR -CONICET); Argentina.Fil: Cricco, Julia Alejandra. Universidad Nacional de Rosario. Facultad de Ciencias Bioquímicas y Farmacéuticas. Instituto de Biología Molecular y Celular de Rosario (IBR -CONICET); Argentina.Fil: Cricco, Julia Alejandra. Universidad Nacional de Rosario. Facultad de Ciencias Bioquímicas y Farmacéuticas. Departamento de Química Biológica. Área Biofísica; Argentina

The Trypanosoma cruzi Protein TcHTE Is Critical for Heme Uptake

Trypanosoma cruzi, the etiological agent of Chagas' disease, presents nutritional requirements for several metabolites. It requires heme for the biosynthesis of several heme-proteins involved in essential metabolic pathways like mitochondrial cytochromes and respiratory complexes, as well as enzymes involved in the biosynthesis of sterols and unsaturated fatty acids. However, this parasite lacks a complete route for its synthesis. In view of these facts, T. cruzi has to incorporate heme from the environment during its life cycle. In other words, their hosts must supply the heme for heme-protein synthesis. Although the acquisition of heme is a fundamental issue for the parasite’s replication and survival, how this cofactor is imported and distributed is poorly understood. In this work, we used different fluorescent heme analogs to explore heme uptake along the different life-cycle stages of T. cruzi, showing that this parasite imports it during its replicative stages: the epimastigote in the insect vector and the intracellular amastigote in the mammalian host. Also, we identified and characterized a T. cruzi protein (TcHTE) with 55% of sequence similarity to LHR1 (protein involved in L. amazonensis heme transport), which is located in the flagellar pocket, where the transport of nutrients proceeds in trypanosomatids. We postulate TcHTE as a protein involved in improving the efficiency of the heme uptake or trafficking in T. cruzi.Fil: Merli, Marcelo Luciano. Universidad Nacional de Rosario. Facultad de Ciencias Bioquímicas y Farmacéuticas. Instituto de Biología Molecular y Celular de Rosario (IBR-CONICET); Argentina.Fil: Pagura, Lucas. Universidad Nacional de Rosario. Facultad de Ciencias Bioquímicas y Farmacéuticas. Instituto de Biología Molecular y Celular de Rosario (IBR-CONICET); Argentina.Fil: Hernández, Josefina. Universidad Nacional de Rosario. Facultad de Ciencias Bioquímicas y Farmacéuticas. Instituto de Biología Molecular y Celular de Rosario (IBR-CONICET); Argentina.Fil: Barisón, María Julia. Universidade de São Paulo. Instituto de Ciências Biomédicas. Departamento de Parasitologia. Laboratory of Biochemistry of Tryps (LaBTryps); Brasil.Fil: Pral, Elizabeth M. F. Universidade de São Paulo. Instituto de Ciências Biomédicas. Departamento de Parasitologia. Laboratory of Biochemistry of Tryps (LaBTryps); Brasil.Fil: Silber, Ariel M. Universidade de São Paulo. Instituto de Ciências Biomédicas. Departamento de Parasitologia. Laboratory of Biochemistry of Tryps (LaBTryps); Brasil.Fil: Cricco, Julia Alejandra. Universidad Nacional de Rosario. Facultad de Ciencias Bioquímicas y Farmacéuticas. Departamento de Química Biológica. Instituto de Biología Molecular y Celular de Rosario (IBR-CONICET); Argentina

Targeting L-Proline uptake as new strategy for anti-chagas drug development

L-Proline is an important amino acid for the pathogenic protists belonging to Trypanosoma and Leishmania genera. In Trypanosoma cruzi, the etiological agent of Chagas disease, this amino acid is involved in fundamental biological processes such as ATP production, differentiation of the insect and intracellular stages, the host cell infection and the resistance to a variety of stresses. In this study, we explore the L-Proline uptake as a chemotherapeutic target for T. cruzi. Novel inhibitors have been proposed containing the amino acid with a linker and a variable region able to block the transporter. A series of sixteen 1,2,3-triazolyl-proline derivatives have been prepared for in vitro screening against T. cruzi epimastigotes and proline uptake assays. We successfully obtained inhibitors that interfere with the amino acid internalization, which validated our design targeting the metabolite’s transport. The presented structures are one of few examples of amino acid transporter inhibitors. The unprecedent application of this strategy on the development of new chemotherapy against Chagas disease, opens a new horizon on antiparasitic drug development against parasitic diseases and other pathologies.Para citar este articulo: Fargnoli L, Panozzo-Zénere EA, Pagura L, Barisón MJ, Cricco JA, Silber AM and Labadie GR (2020) Targeting L-Proline Uptake as New Strategy for Anti-chagas Drug Development. Front. Chem. 8:696. doi: 10.3389/fchem.2020.00696Fil: Fargnoli, Lucía. Universidad Nacional de Rosario. Facultad de Ciencias Bioquímicas y Farmacéuticas. Instituto de Química Rosario (IQUIR -CONICET); Argentina.Fil: Panozzo Zénere, Esteban Andrés. Universidad Nacional de Rosario. Facultad de Ciencias Bioquímicas y Farmacéuticas. Instituto de Química Rosario (IQUIR -CONICET); Argentina.Fil: Pagura, Lucas. Universidad Nacional de Rosario. Facultad de Ciencias Bioquímicas y Farmacéuticas. Instituto de Biología Molecular y Celular de Rosario (IBR -CONICET); Argentina.Fil: Barisón, María Julia. Universidade de São Paulo. Instituto de Ciências Biomédicas. Departamento de Parasitologia. Laboratory of Biochemistry of Tryps (LaBTryps); Brazil.Fil: Cricco, Julia Alejandra. Universidad Nacional de Rosario. Facultad de Ciencias Bioquímicas y Farmacéuticas. Instituto de Biología Molecular y Celular de Rosario (IBR -CONICET); Argentina.Fil: Silber, Ariel M. Universidade de São Paulo. Instituto de Ciências Biomédicas. Departamento de Parasitologia. Laboratory of Biochemistry of Tryps (LaBTryps); Brazil.Fil: Labadie, Guillermo Roberto. Universidad Nacional de Rosario. Facultad de Ciencias Bioquímicas y Farmacéuticas. Instituto de Química Rosario (IQUIR -CONICET); Argentina.Fil: Labadie, Guillermo Roberto. Universidad Nacional de Rosario. Facultad de Ciencias Bioquímicas y Farmacéuticas. Departamento de Química Orgánica; Argentina

A mammary adenocarcinoma murine model suitable for the study of cancer immunoediting

La inmunoedición del cáncer es un proceso dinámico compuesto de tres fases: eliminación (EL), equilibrio (EQ) y escape (ES) que abarca las posibles funciones protectoras del huésped y de esculpir el tumor del sistema inmunitario durante el desarrollo del tumor. Los modelos animales son herramientas útiles para estudiar enfermedades como el cáncer. El presente estudio fue diseñado para caracterizar la interacción entre el adenocarcinoma mamario M-406 y CBi, CBi - y CBi / L líneas de ratones endogámicCancer immunoediting is a dynamic process composed of three phases: elimination (EL), equilibrium (EQ) and escape (ES) that encompasses the potential host-protective and tumor-sculpting functions of the immune system throughout tumor development. Animal models are useful tools for studying diseases such as cancer. The present study was designed to characterize the interaction between mammary adenocarcinoma M-406 and CBi, CBi− and CBi/L inbred mice lines.Fil: Pagura, Lucas. Facultad de Ciencias Bioquímicas y Farmacéuticas. Universidad Nacional de Rosario; Rosario; ArgentinaFil: Cáceres, Juan Manuel. Facultad de Ciencias Médicas. Universidad Nacional de Rosario; Rosario; ArgentinaFil: Cardinali, Albertina. Facultad de Ciencias Médicas. Universidad Nacional de Rosario; Rosario; ArgentinaFil: Scharovsky, Graciela Olga. Institute of Experimental Genetics. School of Medical Sciences. National University of Rosario; Rosario; ArgentinaFil: Di Masso, Ricardo José. Facultad de Ciencias Médicas. Universidad Nacional de Rosario; Rosario; ArgentinaFil: Zacarias-Fluck, Mariano. Preclinical Research. Vall d’Hebron Institute of Oncology (VHIO); Barcelona; SpainFil: Rico, María José. Institute of Experimental Genetics. School of Medical Sciences. National University of Rosario; Rosario; ArgentinaFil: Rozados, Viviana R. Institute of Experimental Genetics. School of Medical Sciences. National University of Rosario; Rosario; Argentin

Proline transport inhibitors trigger differential responses in Trypanosoma cruzi growth inhibition

Background: Proline is a fundamental amino acid for Trypanosoma cruzi, the etiological agent of Chagas disease. Proline is mainly incorporated from the extracellular medium by amino acid transport systems. Different proline analogues proved to interact with the proline permease TcAAAP069 and inhibit the proline uptake by T. cruzi. Methods: Decyl- (1), oleyl- (2) and farnesyl- (3) substituted proline analogues were evaluated on six T. cruzi DTUs. Cell death type was determined by flow cytometry, and the effect on the parasite metabolism was analysed by directed NMR exometabolomics. Structural modifications of 1 (compounds 4 – 6) were implemented to have more information on the mode of action (MoA). Results: The compounds showed broad-spectrum activity against all DTUs. Compound 3 at high concentration (116 µM) induced necrosis. The removal of the triazole from 1 proved to be important for the activity. Compounds 1 and 2 induced deep changes in the exometabolome, diminishing the amounts of succinate, lactate, acetate, and ethanol excreted. The fluorescent labelling and subsequent microscopy showed that compound 1 can be taken up by epimastigotes. Conclusions: Two different MoA related to proline transport for decyl and farnesyl-substituted proline analogues are proposed. The former presented an in-cell action while the latter was not taken up by the parasites but interacted with the extracellular side of the proline permease. General Significance: Subtle structural variations in the compounds determine differences in the MoA. This finding opens new perspectives that should be examined on the development of new drugs targeting metabolite permeases

Mendelian analysis of resistance/susceptibility to a transplantable breast tumor in a murine model

Se estudió el comportamiento del adenocarcinoma de mama M-406, tumor trasplantable tipo B, semi-diferenciado y triple negativo (ER-, PR-, HER-2-), en las poblaciones de ratones F1 y F2 derivadas del cruzamiento entre las líneas endocriadas CBi (susceptible, toma 100 %, letalidad 100 %) y CBi- (resistente, toma 100 %, regresión 100 %). Los híbridos recíprocos se comportaron ambos como CBi (toma 100 %, letalidad 100 %), poniendo de manifiesto ausencia de efectos maternos. En las combinaciones F2, el tumor creció en forma exponencial en 74,9 % de los animales y fue rechazado en el 25,1 % restante; esta segregación compatible con el carácter autosómico dominante de la susceptibilidad al tumor observado en la F1. El análisis del tiempo de duplicación tumoral en las distintas combinaciones F2 mostró mayor velocidad de crecimiento del tumor en aquella con doble dosis genética CBi (susceptible) de origen materno que en aquella con doble dosis materna CBi- (resistente), respuesta que no se evidenció en las dos combinaciones F2 restantes. Esta respuesta sólo fue observada en hembras lo que permite suponer la existencia de fenómenos epigenéticos vinculados con el sexo del portador del tumor.Behavior of breast adenocarcinoma M-406, a type B, semi-differentiated and triple negative (ER, PR-, HER2-) transplantable tumor was studied in the F1 and F2 mice populations derived from crosses between from the inbred lines CBi (susceptible: take 100 %, 100 % lethality) and CBi- (resistant: take 100 %, 100 % regression). Reciprocal hybrids behaved both as CBi (take 100 %, 100 % lethality), revealing the absence of maternal effects. In the F2 combinations, the tumor grew exponentially in 74.9 % of the animals and was rejected in the remaining 25.1 %, a segregation compatible with the autosomal dominant condition of tumor susceptibility observed in the F1. Analysis of tumor doubling time in the various F2 combinations showed a higher growth rate of the tumor when a double genetic load of maternal CBi (susceptible) origin was present in comparison with a double maternal CBi- (resistant) load; this response was not evinced in the remaining two F2 combinations. This response was only observed in females, suggesting the existence of epigenetic phenomena associated with the sex of the tumor carrier.Fil: Cáceres, Juan Manuel. Universidad Nacional de Rosario. Facultad de Ciencias Medicas. Instituto de Genetica Experimental; ArgentinaFil: Pagura, Lucas. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Centro Científico Tecnológico Conicet - Rosario; Argentina. Universidad Nacional de Rosario. Facultad de Ciencias Medicas. Instituto de Genetica Experimental; ArgentinaFil: Di Masso, Ricardo Jose. Universidad Nacional de Rosario. Facultad de Ciencias Medicas. Instituto de Genetica Experimental; ArgentinaFil: Rico, Maria Jose. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Centro Científico Tecnológico Conicet - Rosario; Argentina. Universidad Nacional de Rosario. Facultad de Ciencias Medicas. Instituto de Genetica Experimental; ArgentinaFil: Rozados, Viviana Rosa. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Centro Científico Tecnológico Conicet - Rosario; Argentina. Universidad Nacional de Rosario. Facultad de Ciencias Medicas. Instituto de Genetica Experimental; Argentin

New L-proline uptake inhibitors with anti-Trypanosoma cruzi activity

L-Proline is an important amino acid for the pathogenic protists belonging to Trypanosoma and Leishmania genera. In Trypanosoma cruzi, the etiological agent of Chagas disease, this amino acid is involved in fundamental biological processes such as ATP production, differentiation of the insect and intracellular stages, the host cell infection and the resistance to a variety of stresses, including nutritional and osmotic as well as oxidative imbalance. In this study, we explore the L-Proline uptake as a chemotherapeutic target for T. cruzi. For this, we propose a novel rational to design inhibitors containing this amino acid as a recognizable motif. This rational consists of conjugating the amino acid (proline in this case) to a linker and a variable region able to block the transporter. We obtained a series of sixteen 1,2,3-triazolyl-proline derivatives through alkylation and copper(I)-catalyzed azide-alkyne cycloaddition (click chemistry) for in vitro screening against T. cruzi epimastigotes, trypanocidal activity and proline uptake. We successfully obtained inhibitors that are able to interfere with the amino acid uptake, which validated the first example of a rationally designed chemotherapeutic agent targeting a metabolite\u27s transport. Additionally, we designed and prepared fluorescent analogues of the inhibitors that were successfully taken up by T. cruzi, allowing following up their intracellular fate. In conclusion, we successfully designed and produced a series of metabolite uptake inhibitors. This is one of few examples of rationally designed amino acid transporter inhibitor, being the first case where the strategy is applied on the development of chemotherapy against Chagas disease. This unprecedented development is remarkable having in mind that only a small percent of the metabolite transporters has been studied at the structural and/or molecular level

Heme analogs are transported by amastigotes.

<p>Confocal microscopy images of uninfected Vero cells (A) and infected Vero cells with amastigotes of <i>T</i>. <i>cruzi</i> (B) incubated with 100 μM heme analogs for 30 minutes. The results are representative of at least three independent experiments.</p