Untersuchung von potenziellen Arzneistoffen mit Wirkung auf die ATP-sensitiven Kaliumkanäle in isoliert perfundierten Herzen

Im Herzen kommen ATP-sensitive Kalium-Kanäle (KATP-Kanäle) in drei verschiedenen Strukturen vor: in der sarkolemmalen Zellmembran der Myozyten, in den glatten Muskelzellen der Koronargefäße und in der inneren Mitochondrienmembran von Herzmuskelzellen. Charakterisierung von Inhibitoren des sarkolemmalen KATP-Kanals: Die Aktivierung von sarkolemmalen KATP-Kanälen unter Ischämie führt durch die Erhöhung der K+-Permeabilität zu einer Verkürzung der Aktionspotentialdauer und somit zu einer Heterogenität der Aktionspotentialdauer zwischen normoxischen und ischämischen Gebieten, wodurch kreisende elektrische Erregungen und somit Kammerflimmern entstehen können. Daher stellen Inhibitoren des sarkolemmalen KATP-Kanals ein neues therapeutisches Prinzip gegen den plötzlichen Herztod dar. Diese Inhibitoren sollen möglichst selektiv sein und weder den pankreatischen KATP-Kanal beeinflussen noch die oben beschriebenen KATP-Kanäle in glatten Gefäßmuskelzellen und in Mitochondrien. In dieser Arbeit wurde das Modell des isolierten, perfundierten Herzens nach Langendorff so optimiert, dass Inhibitoren des sarkolemmalen KATP-Kanals unter ischämischen Bedingungen untersucht werden konnten. Hierzu wurden durch eine Verminderung des Koronarflusses und des Sauerstoffs ischämische Bedingungen geschaffen, die zur Verkürzung der Dauer des monophasischen Aktionspotentials (MAPD) führten. In Gegenwart von Inhibitoren des sarkolemmalen KATP-Kanals war diese MAPD-Verkürzung reduziert. Außerdem wurde der Koronarfluss in separaten Experimenten durch Hypoxie erhöht (Vasodilatation). Es wurde untersucht, ob die Inhibitoren des sarkolemmalen KATP-Kanals als Nebenwirkung den Koronarfluss beeinträchtigen. Ausgehend vom bereits therapeutisch eingesetzten Antidiabetikum Glibenclamid wurden verschiedene Strukturvarianten untersucht, um eine Selektivität für sarkolemmale KATP-Kanäle des Myokards zu finden. Die wichtigsten Struktur-Wirkungs-Beziehungen sind folgende: · Der Sulfonylharnstoff Glibenclamid sowie die Benzoesäurederivate Meglitinid und Repaglinid sind unselektive Hemmstoffe der sarkolemmalen und vaskulären KATP-Kanäle. · Eine Schwefelsubstitution im Sulfonylharnstoff zum Sulfonylthioharnstoff (S 94 1638 und HMR 1098) bewirkt eine Verstärkung der Aktivität auf den sarkolemmalen KATP-Kanal sowie eine Verringerung der Effektivität auf den Koronarfluss. · Die meta- statt para-Positionierung der Sulfonylthioharnstoffgruppe führt ohne Beeinflussung des Gefäßtonus zu einer weiteren Verbesserung des Wirkprofils mit einer guten Wirksamkeit auf die ischämische Aktionspotentialverkürzung (HMR 1402 und HMR 1098). · Substitution der Benzamidfunktion von HMR 1402 durch eine Zimtsäuregruppe (S 0000 405) bewirkt eine zur Verringerung der Selektivität. Dies zeigt, dass neben der Sulfonylthioharnstoffgruppe auch die Benzamidfunktion die selektive Wirkung auf sarkolemmale KATP-Kanäle im Herzen beeinflusst. Untersuchung von Aktivatoren des mitochondrialen KATP-Kanals: Öffner des mitochondrialen KATP-Kanals können den endogenen Schutzmechanismus der ischämischen Präkonditionierung nachahmen. Um den neuen mitochondrialen KATP-Öffner S1526 zu untersuchen, wurde an isolierten, perfundierten Rattenherzen eine Globalischämie mit Reperfusion durchgeführt und die Infarktgröße bestimmt. Es konnte nachgewiesen werden, dass Vorbehandlung mit S1526 zu einer signifikanten Reduktion der Infarktgröße führt. Diese Protektion wurde durch den mitochondrialen KATP-Kanalblocker Natrium-5-hydroxydecanoat, nicht aber durch den selektiven sarkolemmalen KATP-Kanal-Blocker HMR 1098 aufgehoben. S1526 hat gegenüber Diazoxid, einem bekannten Öffner des mitochondrialen KATP-Kanals, den Vorteil einer nur geringfügigen Beeinflussung vaskulärer KATP-Kanäle. Daher könnte S1526 als Ausgangspunkt für eine Entwicklung von Arzneistoffen, die eine Verringerung von Ischämieschäden im Herzen bewirken, betrachtet werden

Combined effects of cadmium, hypoxia and temperature on mitochondrial bioenergetics in rainbow trout (Oncorhynchus mykiss)

Aquatic organisms are exposed to diverse and dynamic combinations of stressors in their environment that may interact to alter mitochondrial function. It is important to understand mechanisms of joint effects of stressors to more accurately monitor and predict adverse biological outcomes. I studied the mechanisms of interactions of cadmium (Cd), hypoxia-reoxygenation (H-R) and temperature induced stress on mitochondrial bioenergetics. My overall hypothesis was that when present together Cd, hypoxia and temperature affect common target sites exacerbating single stressor-induced effects on mitochondrial function. In the first investigation I studied the effects of hypoxia-cadmium interactions on rainbow trout (Oncorhynchus mykiss) mitochondrial bioenergetics and showed that H-R enhances the sensitivity of mitochondria to Cd-induced stress. Interestingly, I observed that Cd at low dose attenuates H-R-induced proton leak. In the second study, I investigated how temperature modulates cadmium-induced mitochondrial dysfunction and volume changes. I showed that high temperature exacerbates Cd-induced mitochondrial dysfunction and volume changes in part by increasing metal uptake through the mitochondrial calcium uniporter. In the third study, I investigated the effect of H-R on the thermal sensitivity of complex 1 oxidative capacity. I showed that effects of H-R on mitochondrial function are exacerbated by thermal stress. My fourth study investigated the combined effects of cadmium, temperature and hypoxia-reoxygenation on mitochondrial function. I found that the ternary interactions of Cd, H-R and temperature exacerbate their binary effects on mitochondrial function. I linked the alterations in mitochondrial function to impaired volume homeostasis, complex I A-D transition, dissipation of mitochondrial membrane potential, increased ROS production and loss of structural integrity. Although the effects of Cd and/or H-R were greater at both high and low temperatures, this was not explained by increased Cd accumulation. Overall oxidative stress could explain to a large extent the effects of Cd, H-R and temperature on mitochondrial structure and function. In the fifth study I investigated the role of mitoKATP and the effects of pharmacological modulators on H-R-induced mitochondrial dysfunction. I found that in the presence of Mg-ATP both the opening of mitoKATP channels and bioenergetic effects of diazoxide were protective against the deleterious effects of H-R while in the absence of Mg-ATP only the bioenergetic effects of diazoxide was protective. Overall, my research unearthed previously unknown mechanisms of interactions of Cd, hypoxia and temperature on mitochondrial bioenergetics and increased our understanding of the impact of multiple stressors on cellular energy metabolism in aquatic organisms

Efectos de la genisteína en varios modelos de isquemia-reperfusión cardíaca mediante estudio mecánico-energético

Esta tesis estudió los efectos directos del fitoestrógeno genisteína en varios modelos de isquemia-reperfusión: de no-flujo/reperfusión (I/R) en corazones enteros de rata y cobayo, y de hipoperfusión/reperfusión (HIP/R) en corazones enteros de rata. En estos modelos se generó una recuperación contráctil parcial durante la reperfusión, sin infarto, denominado “corazón atontado”. La disfunción contráctil en estos modelos está acompañada por una elevada liberación de calor que conduce a la disminución de la economía muscular total. Los cambios energéticos reflejan alteraciones en la contractilidad, en la regulación de la [Ca2+]i, en los mecanismos activos de remoción y liberación de Ca2+ al citosol, y en la actividad metabólica mitocondrial. Aunque el fitoestrógeno genisteína es considerado protector cardiovascular, sus efectos directos en el miocardio atontado no estaban establecidos. Conocerlos es de importancia para evaluar una posible acción preventiva de este fitofármaco que se emplea en estados post-menopáusicos y como componente dietético principalmente aportado en la soja. La tesis estudió los efectos de perfundir 2 y 20 μM de genisteína previo a la I/R en corazones de rata o cobayo, puesto que ambos difieren en el grado de participación de mecanismos sarcoreticulares y sarcolemales. Además, puesto que la genisteína es considerado un fitoestrógeno, se evaluaron las diferencias de respuesta entre los dos sexos, tanto en I/R como en HIP/R. Se estudiaron los efectos desarrollados por la perfusión de genisteína directamente en los corazones aislados y contenidos en el interior de un calorímetro de flujo. En otras series experimentales, se estudiaron los efectos producidos después de la administración in vivo de 5 mg/Kg vía intraperitoneal un día antes del experimento de I/R en el corazón aislado. Experimentalmente, se midieron simultáneamente la presión intraventricular izquierda (LVP en mmHg) y el flujo de calor total (Ht en mW/g tejido) de corazones enteros de rata y cobayo introducidos en la cámara interna de un calorímetro de flujo, en forma continua tanto durante la perfusión control (6 ml/min) como en isquemia de no-flujo (por corte global de la perfusión) o en hipoperfusión (por reducir el flujo a 1,2 ml/min). En los modelos de “atontamiento”, los períodos de I/R o de HIP/R se eligieron para lograr una recuperación de alrededor del 50% de la contractilidad inicial en condición control. En corazones de rata se estudió también un modelo de “atontamiento severo” en el que el control recuperó alrededor del 15% de la contractilidad inicial. Los corazones estabilizados dentro del calorímetro se expusieron a diversos protocolos de pretratamiento con genisteína (GST) y/o ciertos inhibidores selectivos de transportadores para evaluar su rol en el efecto. Se hallaron los siguientes resultados principales en los diferentes modelos: a) En el modelo de atontamiento por I/R: en corazones aislados de rata expuestos a 20 min I/45 min R a 37 ºC, GST 20 μM no cambió la recuperación contráctil post-isquémica (RCPI), pero aumentó la velocidad de relajación relativa (-dP/dt/P) de las contracciones en R. Además, mejoró la economía muscular total (P/Ht) sólo cuando estuvo presente desde antes de la I al final de la R. La perfusión de menor concentración de GST 2 μM a 37°C (descripta en plasma de pacientes que consumen fitoestrógenos en la dieta) tampoco modificó la RCPI ni la economía, observando similar efecto que a 20 µM aún en la relajación. Sin embargo, a 30 ºC, en los corazones expuestos a 45 min I/45 min R, GST 20 µM redujo la RCPI tanto en corazones de ratas como de cobayos macho (M), sin modificar la RCPI de las hembras (H), con similares comportamientos de la economía. La inhibición de tirosina fosfatasas con orto-vanadato (OVN) durante la perfusión con 20 μM GST previno la disminución de la RCPI en corazones de rata M, sugiriendo que el efecto inotrópico negativo de GST es debido a la inhibición de tirosina-quinasas (TK). Reperfundiendo los corazones isquémicos con Krebs-10 mM cafeína-36 mM Na+ se indujo una contractura dependiente del contenido de Ca2+ sarcoreticular, y una liberación de calor que representa el ciclaje de Ca2+ a través de los varios transportadores involucrados. La relajación de la contractura depende principalmente de la recaptación mitocondrial de Ca2+ en estas condiciones, y GST redujo esa velocidad de relajación a 30⁰C. En corazones de cobayo, GST 20 μM mantuvo la protección del precondicionamiento (PC) isquémico previo a los 30 min I/45 min R, pero ambos efectos fueron reducidos (cayó la RCPI) por el bloqueante selectivo de los canales de K+ mitocondriales (KATPm) 5-hidroxidecanoato, sugiriendo la participación de los KATPm en el efecto de GST y del PC. b) En cardiomiocitos aislados de rata y perfundidos en medio aeróbico, GST 20 μM previno el aumento en la fluorescencia de Rhod-2 ([Ca2+]m libre) y demoró la caída de la señal fluorescente de Fluo-4 ([Ca2+]i libre citosólico) ambos provocados por la perfusión de un Krebs-10 mM cafeína-36 mM Na+. c) Efectos de GST en el modelo de atontamiento con estimulación simpática: se encontró que 20 μM GST redujo la disfunción provocada por adrenalina en el modelo de atontamiento por I/R, mejorando la RCPI y la economía (P/Ht). Esta interacción sugirió que GST redujo la sobrecarga de Ca2+ inducida por adrenalina. d) En el modelo de atontamiento severo por I/R: en corazones aislados de rata a 37 ºC, GST 5 mg/Kg administrada vía intraperitoneal 24 horas antes del experimento mejoró la RCPI de corazones expuestos a 30 min I seguido de 45 min R, especialmente en corazones de rata macho. Este efecto no estuvo asociado a la inhibición de las tirosina-kinasas (no se modificaron por tratamiento previo con OVN), ni a cambios en el contenido de Ca2+ del RS (no alteró la contractura provocada por Krebs-10 mM cafeína-36 mM Na+). e) En el modelo de hipoperfusión/reperfusión (HIP/R): inicialmente se caracterizó el rol de los transportadores de Ca2+ mitocondriales en este modelo. Se logró mejorar la RCPI y la economía durante la hipoperfusión cuando se pretrataron con clonazepam 10 μM, el cual inhibe al NXCm, sugiriendo el rol cardioprotector de conservar más Ca2+ en las mitocondrias durante la hipoperfusión. Otros transportadores mitocondriales (UCam y KATPm) no ejercieron un rol cardioprotector en la HIP/R. Luego, 20 μM GST generó el mismo patrón de comportamiento que en el atontamiento por I/R a 37°C, es decir que M y H no alteraron la RCPI ni la economía. Pero al combinar la perfusión de GST luego y en simultáneo con la de clonazepam se observó una disfunción muy acentuada: reducción de RCPI y economía, y gran contractura. Esta disfunción fue atenuada por la simultánea perfusión de ciclosporina A, lo cual sugiere que hay una gran alteración en la homeostasis de Ca2+ con apertura del mPTP al interferirse los transportadores mitocondriales UCam y NXCm. Por otro lado, cuando el modelo de HIP/R se realizó 24 horas después de la administración IP de 5 mg/Kg de GST en corazones de rata macho, se obtuvo cardioprotección con aumentos de la RCPI y la economía (P/Ht). Estos resultados sugieren que GST actúa en varios mecanismos que regulan la homeostasis de calcio miocárdica y la energética durante la I/R, los cuales difieren con la temperatura y el género. Entre ellos, hemos caracterizado a los siguientes: a) Una inhibición del influjo de Ca2+ por canales L, más notoria en machos que en hembras y a baja temperatura (30 ºC), que es dependiente de la inhibición de TK. b) un aumento de la velocidad de relajación de las contracciones, posiblemente por aumentar la captación sarcoreticular de Ca2+, el cual fue evidente tanto a 30ºC como a 37ºC pero fue enmascarado por la acción lusitrópica propia de la adrenalina. d) un aumento del leak de Ca2+ del RS dependiente de la temperatura, ya que fue evidenciado por el aumento de la LVEDP durante la R en los corazones tratados con GST a 37 ºC, aun en las condiciones de cardioprotección. e) una disminución de la captación de Ca2+ mitocondrial, evidenciado en cardiomiocitos aislados y en corazones en I/R a 30 ºC, cuando se perfundieron con Krebs-10 mM cafeína-36 mM Na+. e) una acción cardioprotectora cuando se administró in vivo, que podría estar asociada a la interacción agonista competitiva con el estradiol endógeno a nivel de los receptores estrogénicos, puesto que la RCPI y la economía mejoraron mucho mas en el tratamiento in vivo de rata macho que en el de rata hembra. La dosis de 5 mg/Kg evaluada en esta tesis es comparable a la administrada en humanos terapéuticamente (70 mg/día de isoflavonas de soja). En conclusión, esta tesis valida el efecto benéfico de la administración in vivo de GST en un individuo, especialmente si tiene reducido nivel estrogénico, como preventivo del atontamiento miocárdico disparado por la reducción del flujo coronario. Además, establece algunos de los mecanismos determinantes de tal protección a nivel de la homeostasis de Ca2+ y la energética miocárdica.Facultad de Ciencias Exacta