Analysis of neuroblastoma pathogenesis from neural crest precursor cells in vitro and in vivo

Das Neuroblastom (NB) ist der häufigste extrakranielle Tumor des Kindesalters. Es deuten viele Hinweise darauf hin, dass das NB aus Neuralleistenvorläuferzellen (NLVZ) entsteht. In dieser Arbeit wurde eine durch c-Myc immortalisierte NLVZ-Linie genutzt, um die initiale Pathogenese des NB zu untersuchen. Durch Transfektion der NLVZ-Linie JoMa1 mit MYCN, LIN28b, FOXR1, ALK-WT ALK[F1174L] und ALK[R1275Q] konnte gezeigt werden, dass NLVZ durch potentielle Onkogene des NB in vitro transformiert werden können. Weiterhin konnte gezeigt werden, dass JoMa1 Zellen durch MYCN und ALK[F1174L] derart transformiert werden, dass sie in vivo NB ähnliche Tumore bilden. Darüber hinaus zeigten die durch JoMa1-MYCN entstandenen Tumoren, spezifische chromosomale Aberrationen, die homolog zu denen des humanen NB sind. Außerdem wiesen die Tumoren mikroskopische Strukturen auf, die typisch für neuroendokrine Tumoren sind. Es wurde jedoch auch deutlich, dass nicht die Überexpression jedes x-beliebigen Gens zur Transformierung von NLVZ in vitro und in vivo führt. Die Gene TrkA, miR-17-92, MLL-FOXR1 und GFP lösten keine Transformierung in JoMa1-Zellen aus. Zusammengenommen zeigen diese Resultate, dass sich JoMa1 als Modell für die funktionelle Untersuchung NB-relevanter Onkogene eignet. Gestützt von in vitro Daten und Hochdurchsatzanalysen wurde LIN28b als wichtiges Onkogen im NB identifiziert. LIN28b ist häufig genomisch amplifiziert und hoch exprimiert. Molenaar et al. zeigten, dass LIN28b in humanen NB Zelllinien entscheidend für die Viabilität ist. Darüber hinaus wurde deutlich, dass LIN28b in humanen NB Zelllinien miRNAs der let-7 Familie reprimierte, was zu De-Reprimierung von MYCN führte und die Viabilität steigerte. Diese LIN28b-let-7-Mycn regulatorische Achse ließ sich auch in JoMa1 Zellen, die mit LIN28b transfiziert wurden, nachweisen. Mittels der in dieser Arbeit etablierten und charakterisierten transgenen LSL-Lin28b (Lox-Stop-Lox-Lin28b-IRES-FLuc) Maus sollte die neuralleistenspezifische Expression von Lin28b näher untersucht werden. Dafür wurden die LSL-Lin28b Mäuse mit Dbh-iCre Mäusen verpaart. LSL-Lin28b;Dbh-iCre doppelt transgene Mäuse exprimieren konditional Lin28b in der Neuralleiste und in Neuralleistenderivaten. 35% dieser doppelt transgenen Mäuse entwickelten mit einem durchschnittlichen Altern von 65 Tagen tastbare Tumoren. Die Tumoren entstanden aus den Neuralleistenderivaten, aus denen sie auch beim humanen NB entstehen (z.B. Nebennierenmark). Mittels Luciferase-Aktivitäts-Bestimmung konnte gezeigt werden, dass Lin28b in den Tumoren exprimiert wird. Die Untersuchung der Tumoren hinsichtlich der Expression humaner NB Markergene zeigte, dass es sich bei den Tumoren um murine NB handelte. Die Tumoren exprimierten Dbh, Th und NSE. Interessanterweise wiesen diese Tumore chromosomale Aberrationen auf, die zu denen des humanen NB homolog sind. Wie in JoMa1-LIN28b, so konnte auch in den Tumoren des LSL-Lin28b;Dbh-iCre Mausmodells die funktionale regulatorische Lin28b-let-7-Mycn Achse nachgewiesen werden. Abschließend konnte gezeigt werden, dass der Bromodomänen-Inhibitor JQ1 die Mycn Expression und Mycn gesteuerte Transkription inhibiert. Dies hatte zur Folge, dass die Apoptose in den Tumoren stark erhöht war und die Proliferation stark gesenkt wurde. Das LSL-Lin28b;Dbh-iCre Mausmodell stellt damit ein präklinisches Modell zur Untersuchung der NB Pathogenese dar.Neuroblastoma is presumed to arise from the neural crest, whereas the cells of origin remain to determined. To date, few recurrent genetic changes contributing to neuroblastoma formation, such as amplification of the MYCN oncogene and activating mutations of the ALK oncogene, have been identified. The possibility to model neuroblastoma in mice allows investigation of the cells of origin hypothesis in further detail. Murine neural crest progenitor cells, JoMa1 cell line, were maintained in an undifferentiated state by a tamoxifen-activated c-Myc transgene (c-Myc-ERT). Either MYCN, ALK[F1174L], one of the oncogenic ALK variants identified in primary neuroblastomas, TrkA or GFP were ectopically expressed. Subsequently, growth independence of c-Myc-ERT transgene was monitored in vitro, and tumorigenicity of transfected cells was evaluated in an in vivo model. JoMa1 cells expressing MYCN or ALK[F1174L] were able to grow independently of c-Myc-ERT activity in vitro and caused formation of tumors in vivo, in contrast to parental JoMa1 cells and JoMa1 cells expressing TrkA, miR-17-92, MLL-FOXR1 or GFP. Tumors resembled human neuroblastomas in morphology, expression of neuroblastoma marker genes TH, Phox2b, DC56 and in the presence of neurosecretory vesicles and synaptic structures as determined by electron microscopy. Tumorigenicity was enhanced upon serial transplantation of tumor-derived cells. Our findings support neural crest progenitor cells as the precursor cells of neuroblastoma, and indicate that neuroblastoma arise as their malignant progeny. The JoMa1 model system is a valid and fast tool to analyze the effect of genes suspected to contribute to neuroblastomagenesis in an in vivo model or to implement screening strategies to identify such genes. The former strategy has already been successfully applied for FOXR1, LIN28b and miR-17-92. Overexpression of LIN28b has been reported in neuroblastomas (NB). LIN28b is known to repress let-7 miRNAs, which target MYCN. We overexpressed murine Lin28b in the neural crest to determine if Lin28b can drive neuroblastomagenesis. Conditional murine Lin28b expressing mice (LSL-Lin28b) were crossbred with Dbh-iCre mice to target expression to the neural crest. Arising tumors were characterized using histology, immunohistochemistry, PCR and western blotting. 30% of all LSL-Lin28b;Dbh-iCre double-transgenic mice developed tumors at a median age of 65 days. The macroscopic tumor appearance, primary tumor sites, tumor histology and marker gene expression confirmed these tumors as murine NB. Lin28b and Mycn proteins were expressed in all tumors and let-7 miRNAs were downregulated. Treating mice with the bromodomain inhibitor JQ1 resulted in enhanced cell death and decreased cell proliferation. Our results suggest that, similar to human NB, MYCN is induced via downregulation of let-7 miRNAs by Lin28b. Therapeutic approaches aimed at inhibiting Lin28b-let-7 interaction may be a useful therapeutic perspective

Physical and chemical features of hydrophilic microarc biocoatings based on substituted hydroxyapatite

The physical and chemical properties as topography, morphology, chemical composition and wettability of microarc calcium phosphate coatings based on Zn- and Cu- substituted hydroxyapatite on the Ti-40mas.%Nb alloy surface has been investigated. It have been found that calcium phosphate coatings on Ti-40mas.%Nb alloy produced under 200 V have X-ray amorphous state and as consequence high rate of dissolution. The phase composition of the coatings produced under 300 V is presented the following phases: CaHPO4,beta-Ca[2]P[2]O[7], Ca[2]Nb[2]O[7], NbO[2], Nb[2]O[5], TiO[2]. It has been shown that the biocoatings are very hydrophilic

Long non-coding RNAs as novel components in the TP53 pathway

C

Arrays of Regenerated Fiber Bragg Gratings in Non-Hydrogen-Loaded Photosensitive Fibers for High-Temperature Sensor Networks

We report about the possibility of using regenerated fiber Bragg gratings generated in photosensitive fibers without applying hydrogen loading for high temperature sensor networks. We use a thermally induced regenerative process which leads to a secondary increase in grating reflectivity. This refractive index modification has shown to become more stable after the regeneration up to temperatures of 600 °C. With the use of an interferometric writing technique, it is possible also to generate arrays of regenerated fiber Bragg gratings for sensor networks

International competitiveness of the european economy with regard to the EU state aid policy: the case of nanoelectronics. Summary

The domestic growth of high-tech industries is seen as central to future economic development in many countries. In this context, companies are often granted high levels of state support (e.g. through subsidies or tax breaks) to promote growth and employment in these promising sectors or fields of technology. In Europe, however, state support opportunities are regulated by EU state aid control. The aim is to reduce state aid from member states in order to promote European integration and free competition within Europe. State aid is only granted by EU member states under certain conditions Subject and objective of the project The impact of EU state aid control on national policy-making in the field of nanoelectronics is being discussed particularly intensively. Nanoelectronics is regarded as an important cross-sectional technology or industry whose components are in demand and used in numerous user industries. In particular, the construction of new production facilities is massively supported by some states, and at the same time production sites are increasingly being established outside Europe. The effects of EU state aid control on the competitiveness of Europe and its member states such as Germany are generally complex and above all indirect. They depend centrally on the development of other factors in the innovation system (e.g. demand, domestic establishment of user industries), the interaction of these factors, the use of complementary policy instruments and the extent of public support in non-European countries. The Innovation Report therefore examines the following research questions: Which factors influence the attractiveness of individual countries as locations for nanoelectronics? How should the current competitiveness in Germany and Europe be assessed? What consequences would a loss of production capacities have for the entire "nanoelectronics innovation system"? To what extent is there a situation in the field of nanoelectronics that justifies state aid? How can a sustainable funding policy be implemented, especially under the given conditions of limited state aid possibilities? To what extent can the example of nanoelectronics be transferred to other technologies and sectors

Immunoprophylaxis as a method to help reduce the incidence of Salmonella infection in swine

Swine reared for fattening which were clinically proven to have salmonellosis (S. typhimuriwn) were immunized with a S. typhimurium live vaccine to prevent clinical disease and reduce the level of infection amongst the swine. To assess the outcome of vaccination the ileocaecal lymph nodes of the swine were removed at the time of slaughter and cultures set up to establish the presence of salmonella. In addition, serum samples were taken and assayed for antibodies to S. typhimurium. Use of the vaccine prevented animals from developing clinical disease and resulted in a marked reduction in the isolation of S. typhimurium from the ileocaecal lymph nodes of the swine at slaughter and in the number of animals with high antibody value (≥40 OD%)

Investigation of the efficacy of a genetically-stabile live Salmonella typhimurium vaccine for use in swine

Hybrid swine were immunized twice at an interval of 3 weeks to evaluate the efficacy of a liveS. typhimurium vaccine. The animals and a control group were challenged at the age of 8-10 weeks by oral test infection with a labelled S. typhimurium DT l 04 strain. An ELISA was used to establish the presence of antibodies to S. typhimurium in serum samples. The presence of the challenge strain in the ileal and caecal mucosa and in the ileocolic lymph nodes was investigated quantitatively using the Koch plating method. The vaccinated animals had significantly higher antibody titres after the second vaccination than the unvaccinated animals. The vaccinated animals had a significantly lower (p \u3c 0.05) colonization of the ileal and caecal mucosa as well as the ileocolic lymph nodes than the unvaccinated animals

Wettbewerbsfähigkeit der europäischen Wirtschaft im Hinblick auf die EU-Beihilfepolitik - am Beispiel der Nanoelektronik. Innovationsreport

Das inländische Wachstum von Hightech-Branchen wird in vielen Ländern als zentral für die zukünftige wirtschaftliche Entwicklung angesehen. Dabei werden Unternehmen häufig hohe staatliche Unterstützungen (z. B. durch Subventionierung oder Steuervergünstigungen) gewährt, um Wachstum und Beschäftigung in diesen zukunftsträchtigen Sektoren oder Technikfeldern zu fördern. In Europa werden die staatlichen Unterstützungsmöglichkeiten jedoch durch die EU-Beihilfekontrolle reguliert. Ziel ist die Reduzierung staatlicher Beihilfen der Mitgliedstaaten, um die europäische Integration und den freien Wettbewerb innerhalb Europas voranzutreiben. Nur unter bestimmten Voraussetzungen werden staatliche Beihilfen von EU-Mitgliedstaaten gewährt Gegenstand und Ziel der Untersuchung Besonders intensiv werden die Auswirkungen der EU-Beihilfekontrolle auf die nationale Politiksteuerung im Bereich der Nanoelektronik diskutiert. Die Nanoelektronik gilt als wichtige Querschnittstechnologie bzw. Branche, deren Komponenten in zahlreichen Anwenderbranchen nachgefragt und eingesetzt werden. Vor allem der Bau von neuen Produktionsstätten wird massiv von einigen Staaten unterstützt, und zugleich werden Produktionsstandorte zunehmend außerhalb Europas aufgebaut. Die Auswirkungen der EU-Beihilfekontrolle auf die Wettbewerbsfähigkeit Europas bzw. ihrer Mitgliedsländer wie Deutschland sind insgesamt vielschichtig und vor allem indirekter Natur. Sie hängen zentral von der Ausprägung anderer Faktoren im Innovationssystem (z. B. Nachfrage, inländische Ansiedlungen von Anwenderbranchen), dem Zusammenspiel dieser Faktoren, der Nutzung komplementärer, politischer Instrumente sowie dem Ausmaß öffentlicher Unterstützung in außereuropäischen Staaten, ab. Der Innovationsreport untersucht daher folgende Forschungsfragen: Welche Faktoren beeinflussen die Standortattraktivität einzelner Länder in der Nanoelektronik? Wie ist die aktuelle Wettbewerbsfähigkeit am Standort Deutschland und in Europa zu beurteilen? Welche Folgen hätte ein Verlust der Produktionskapazitäten für das gesamte »Innovationssystem Nanoelektronik«? Inwieweit besteht im Bereich der Nanoelektronik eine Situation, die staatliche Beihilfe rechtfertigen lässt? Wie kann eine nachhaltige Förderpolitik gerade unter den gegebenen Bedingungen der eingeschränkten staatlichen Beihilfemöglichkeiten erfolgen? Inwieweit lässt sich das Beispiel der Nanoelektronik auf andere Technologien und Branchen übertragen? INHALT ZUSAMMENFASSUNG 5 I. EINLEITUNG 19 1. Zielsetzung 19 2. Aufbau des Berichts 21 3. Quellen und Methoden 22 II. WETTBEWERBSFÄHIGKEIT DER EUROPÄISCHEN WIRTSCHAFT IN HIGHTECHBRANCHEN MIT FOKUS AUF DIE NANOELEKTRONIK 27 1. Europäische Wettbewerbsfähigkeit in Hightechbranchen 27 1.1 Bedeutung der Hightechbranchen und internationaler Wettbewerbsvergleich 29 1.2 Aktuelle Krisensituation und Ausblick 34 2. Entwicklung in der Nanoelektronik und Vergleich der internationalen Wettbewerbsfähigkeit führender Länder 37 2.1 Nanoelektronik: Definition, Bereiche und Bedeutung 37 2.2 Produktions- und Beschäftigungsentwicklung 42 3. Einflussfaktoren für die Innovations- und Wettbewerbsfähigkeit Europas in der Nanoelektronik 48 3.1 Wissensbasis 48 3.2 Wissenstransfer und Vernetzung 52 3.3 Industrielle Akteure und Produktion 61 3.4 Nachfrage und Rahmenbedingungen 70 4. Zwischenfazit 75 III. POLITIKMASSNAHMEN IN FÜHRENDEN LÄNDERN IN DER NANOELEKTRONIK 77 1. Förderung der Nanoelektronik in Europa 78 1.1 Ansätze und Strukturen der europäischen Forschungspolitik 78 1.2 Deutschland 85 1.3 Frankreich 94 2. Globale Förderung in der Nanoelektronik 100 2.1 Taiwan 100 2.2 China 106 2.3 Japan 113 2.4 Südkorea 117 2.5 USA 121 3. Zwischenfazit 127 IV. EU-BEIHILFENKONTROLLE: ZIELE, RECHTFERTIGUNG UND BEDEUTUNG FÜR DIE NANOELEKTRONIK 131 1. Rechtfertigungsgründe für staatliche Beihilfen sowie deren Kontrolle 131 1.1 Rechtfertigungsgründe für staatliche Beihilfen mit Fokus auf die Nanoelektronik 131 1.2 Risiken staatlicher Eingriffe und Gründe für eine strikte EU-Beihilfenkontrolle 147 2. Charakterisierung der EU-Beihilfenkontrolle 152 2.1 Intention der Beihilfenkontrolle und Bedeutung für die europäische Integration 152 2.2 Darstellung der Beihilfenkontrolle 153 2.3 Verfahren der Beihilfenkontrolle und Verteilung der Kompetenzen 159 2.4 Weitere internationale Regelungen 161 3. Empirische Analyse der staatlichen Beihilfen in der Europäischen Union 163 3.1 Entwicklung der allgemeinen staatlichen Beihilfen 163 3.2 Bedeutung der Beihilfenkontrolle für die Nanoelektronik 166 4. Zwischenfazit 175 V. SCHLUSSFOLGERUNGEN UND HANDLUNGSOPTIONEN 179 1. Einleitende Bemerkungen 179 2. Allgemeine Handlungsoptionen 182 3. Rahmensetzende Politik 187 4. Aktive sektorale Technologie-/Industriepolitik 195 5. Zusammenfassung der Handlungsoptionen 206 VI. LITERATUR 209 VII. ANHANG 223 1. Tabellenverzeichnis 223 2. Abbildungsverzeichnis 224 3. Übersichten 22

Integrating biological vasculature into a multi-organ-chip microsystem

Dieser Beitrag ist mit Zustimmung des Rechteinhabers aufgrund einer (DFG geförderten) Allianz- bzw. Nationallizenz frei zugänglich.This publication is with permission of the rights owner freely accessible due to an Alliance licence and a national licence (funded by the DFG, German Research Foundation) respectively.A chip-based system mimicking the transport function of the human cardiovascular system has been established at minute but standardized microsystem scale. A peristaltic on-chip micropump generates pulsatile shear stress in a widely adjustable physiological range within a microchannel circuit entirely covered on all fluid contact surfaces with human dermal microvascular endothelial cells. This microvascular transport system can be reproducibly established within four days, independently of the individual endothelial cell donor background. It interconnects two standard tissue culture compartments, each of 5 mm diameter, through microfluidic channels of 500 μm width. Further vessel branching and vessel diameter reduction down to a microvessel scale of approximately 40 μm width was realised by a two-photon laser ablation technique applied to inserts, designed for the convenient establishment of individual organ equivalents in the tissue culture compartments at a later time. The chip layout ensures physiological fluid-to-tissue ratios. Moreover, an in-depth microscopic analysis revealed the fine-tuned adjustment of endothelial cell behaviour to local shear stresses along the microvasculature of the system. Time-lapse and 3D imaging two-photon microscopy were used to visualise details of spatiotemporal adherence of the endothelial cells to the channel system and to each other. The first indicative long-term experiments revealed stable performance over two and four weeks. The potential application of this system for the future establishment of human-on-a-chip systems and basic human endothelial cell research is discussed.BMBF, 0315569, GO-Bio 3: Multi-Organ-Bioreaktoren für die prädiktive Substanztestung im Chipforma