Qualification d’hydrogels physiques de chitosane et de progéniteurs endothéliaux humains pour l’ingénierie vasculaire

Depuis près de 20 ans, l’ingénierie vasculaire est en plein essor, tentant d’apporter des solutions durables dans le traitement de pathologies cardio-vasculaires dont l’incidence est croissante. Utilisés pour le remplacement ou le pontage de vaisseaux obstrués voire lésés, les substituts vasculaires de petit calibre présentent encore des limites importantes, induisant, à plus ou moins court terme, le développement d’hyperplasie intimale ou de thrombose. Les multiples exemples de substituts vasculaires issus de l’ingénierie tissulaire décrits dans la littérature témoignent des difficultés rencontrées pour obtenir une prothèse qui réunirait à la fois des propriétés mécaniques adaptées au site d’implantation et des propriétés biologiques optimales pour assurer la fonction vasculaire. C’est dans cette problématique que se situe cette étude dont l’objectif est de définir la composante matricielle et la composante cellulaire idéales pour un substitut vasculaire de petit calibre. Pour cela, nous nous sommes intéressés aux hydrogels physiques de chitosane, dont les propriétés d’hémocompatibilité et de biorésorption sont reconnues. La composition physico- chimique adéquate d’un point de vue biologique et mécanique a été déterminée afin d’élaborer des tubes qui ont été par la suite endothélialisés. Par ailleurs, le mécanisme d’alignement cellulaire en réponse à un flux laminaire de type artériel, a été particulièrement étudié car il constitue un phénomène d’adaptation des CEs aux contraintes mécaniques perçues in vivo par l’endothélium. Cette caractérisation a permis de mettre en évidence le rôle essentiel d’IQGAP1 dans ce processus et d’initier une seconde étude visant la compréhension du mécanisme d’adhésion des CEs sur le chitosane. Finalement, en alliant recherche fondamentale et recherche appliquée nous avons élaboré un substitut vasculaire cellularisable in vitro et implantable in vivo.Abstrac

Qualification d’hydrogels physiques de chitosane et de progéniteurs endothéliaux humains pour l’ingénierie vasculaire

Depuis près de 20 ans, l’ingénierie vasculaire est en plein essor, tentant d’apporter des solutions durables dans le traitement de pathologies cardio-vasculaires dont l’incidence est croissante. Utilisés pour le remplacement ou le pontage de vaisseaux obstrués voire lésés, les substituts vasculaires de petit calibre présentent encore des limites importantes, induisant, à plus ou moins court terme, le développement d’hyperplasie intimale ou de thrombose. Les multiples exemples de substituts vasculaires issus de l’ingénierie tissulaire décrits dans la littérature témoignent des difficultés rencontrées pour obtenir une prothèse qui réunirait à la fois des propriétés mécaniques adaptées au site d’implantation et des propriétés biologiques optimales pour assurer la fonction vasculaire. C’est dans cette problématique que se situe cette étude dont l’objectif est de définir la composante matricielle et la composante cellulaire idéales pour un substitut vasculaire de petit calibre. Pour cela, nous nous sommes intéressés aux hydrogels physiques de chitosane, dont les propriétés d’hémocompatibilité et de biorésorption sont reconnues. La composition physico- chimique adéquate d’un point de vue biologique et mécanique a été déterminée afin d’élaborer des tubes qui ont été par la suite endothélialisés. Par ailleurs, le mécanisme d’alignement cellulaire en réponse à un flux laminaire de type artériel, a été particulièrement étudié car il constitue un phénomène d’adaptation des CEs aux contraintes mécaniques perçues in vivo par l’endothélium. Cette caractérisation a permis de mettre en évidence le rôle essentiel d’IQGAP1 dans ce processus et d’initier une seconde étude visant la compréhension du mécanisme d’adhésion des CEs sur le chitosane. Finalement, en alliant recherche fondamentale et recherche appliquée nous avons élaboré un substitut vasculaire cellularisable in vitro et implantable in vivo.Abstrac

Insights into the osteoblast precursor differentiation towards mature osteoblasts induced by continuous BMP-2 signaling

Summary Mature osteoblasts are the cells responsible for bone formation and are derived from precursor osteoblasts. However, the mechanisms that control this differentiation are poorly understood. In fact, unlike the majority of organs in the body, which are composed of “soft” tissue from which cells can easily be isolated and studied, the “hard” mineralized tissue of bone has made it difficult to study the function of bone cells. Here, we established an in vitro model that mimics this differentiation under physiological conditions. We obtained mature osteoblasts and characterized them on the basis of the following parameters: the strong expression of osteoblastic markers, such as Runx2 and Col-I; the achievement of specific dimensions (the cell volume increases 26-fold compared to the osteoblast precursors); and the production of an abundant extracellular matrix also called osteoid. We demonstrated that the differentiation of osteoblast precursors into mature osteoblasts requires the continuous activation of Bone Morphogenetic Protein (BMP) receptors, which we established with the immobilization of a BMP-2mimetic peptide on a synthetic matrix mimicking in vivo microenvironment. Importantly, we demonstrated that the organization of the F-actin network and acetylated microtubules of the cells were modified during the differentiation process. We showed that the perturbation of the F-actin cytoskeleton organization abolished the differentiation process. In addition, we demonstrated that expression of the Runx2 gene is required for this differentiation. These findings demonstrate the retro-regulation of cytoplasmic and genic components due to the continuous induction of BMP-2 and also provide more detailed insights into the correct signaling of BMPs for cell differentiation in bone tissue

IQ domain GTPase-activating protein 1 is involved in shear stress-induced progenitor-derived endothelial cell alignment.

Shear stress is one of mechanical constraints which are exerted by blood flow on endothelial cells (ECs). To adapt to shear stress, ECs align in the direction of flow through adherens junction (AJ) remodeling. However, mechanisms regulating ECs alignment under shear stress are poorly understood. The scaffold protein IQ domain GTPase activating protein 1 (IQGAP1) is a scaffold protein which couples cell signaling to the actin and microtubule cytoskeletons and is involved in cell migration and adhesion. IQGAP1 also plays a role in AJ organization in epithelial cells. In this study, we investigated the potential IQGAP1 involvement in the endothelial cells alignment under shear stress. Progenitor-derived endothelial cells (PDECs), transfected (or not) with IQGAP1 small interfering RNA, were exposed to a laminar shear stress (1.2 N/m(2)) and AJ proteins (VE-cadherin and β-catenin) and IQGAP1 were labeled by immunofluorescence. We show that IQGAP1 is essential for ECs alignment under shear stress. We studied the role of IQGAP1 in AJs remodeling of PDECs exposed to shear stress by studying cell localization and IQGAP1 interactions with VE-cadherin and β-catenin by immunofluorescence and Proximity Ligation Assays. In static conditions, IQGAP1 interacts with VE-cadherin but not with β-catenin at the cell membrane. Under shear stress, IQGAP1 lost its interaction from VE-cadherin to β-catenin. This "switch" was concomitant with the loss of β-catenin/VE-cadherin interaction at the cell membrane. This work shows that IQGAP1 is essential to ECs alignment under shear stress and that AJ remodeling represents one of the mechanisms involved. These results provide a new approach to understand ECs alignment under to shear stress

Marqueurs biologiques du diabète : apports et discordances des nouvelles technologies. À propos d’un cas clinique

Des discordances potentielles sont observées par les praticiens de diabétologie chez certains patients entre les marqueurs « classiques » du diabète (hémoglobine A1c, HbA1c) et les « nouveaux » marqueurs issus du monitorage continu du glucose (CGM, Continuous Glucose Monitoring). Les dispositifs de CGM donnent une HbA1c estimée ou eA1c, calculée selon la glycémie interstitielle moyenne et corrélée au temps relatif passé dans la cible glycémique ou Time-in-Range (TIR, %). Nous rapportons, à travers un cas clinique, l’existence de discordances et explorons leurs causes potentielles. L’eA1c est rendue sur la base des données recueillies par un capteur dont la durée de vie est de 14 jours, et l’HbA1c est un reflet rétrospectif sur 8 à 12 semaines de l’exposition à l’hyperglycémie. La patiente présentait un mauvais contrôle glycémique, se traduisant par une eA1c à 9 % contre une HbA1c dosée à 7,4 % et 7,7 % respectivement en immuno-dosage délocalisé (Siemens DCA- Vantage®) et en HPLC (Variant II Turbo). En plus des données du CGM, le déséquilibre glycémique et son caractère récent ont pu être objectivés par une fraction labile de l’HbA1c (LA1c) augmentée en HPLC. Ainsi, des variations récentes et/ou importantes du contrôle glycémique vont creuser un écart entre l’HbA1c et l’eA1c, pouvant induire des décisions thérapeutiques erronées. La nature différente des marqueurs les rend difficilement comparables en particulier en termes de durée de mesure. Ces dispositifs de lecture du glucose interstitiel en continu sont largement utilisés, il est important de comprendre et maîtriser les données qu’ils fournissent

Physicochemical modulation of chitosan-based hydrogels induces different biological responses: Interest for tissue engineering

Polysaccharide-based hydrogels are remarkable materials for the development of tissue engineering strategies as they meet several critical requirements for such applications and they may partly mimic the extracellular matrix. Chitosan is widely envisioned as hydrogel in biomedical fields for its bioresorbability, biocompatibility, and fungistatic and bacteriostatic properties. In this study, we report that the modulation of the polymer concentration, the degree of acetylation, the gelation processes [or neutralization routes (NR)] in the preparation of different chitosan-based hydrogels lead to substantially and significantly different biological responses. We show that it is possible to tune the physicochemical characteristics, mechanical properties, and biological responses of such matrices. Physical hydrogels prepared from highly acetylated chitosan were softer, degraded quickly in vivo, and were not suitable for in vitro culture of human mesenchymal stem and progenitor derived endothelial cells. In contrast, for a same chitosan concentration and obtained by the same processing route, a low degree of acetylation chitosan hydrogel provided a more elastic material, better cell adhesion on its surface and tissue regeneration, and restored tissue neo-vascularization as well. This work offers promising and innovative perspectives for the design of hydrogel materials with tunable properties for tissue engineering and regenerative medicine

IQGAP1 downregulation induces the lack of cell cohesiveness.

<p>In (A) are represented immunofluorescence staining of VE-cadherin and β-catenin in PDECs transfected with siIQGAP1 or siLUC, under static conditions. VE-cadherin and β-catenin expression were discontinuous at the cell membrane in siIQGAP1-transfected PDECs (arrows). Arrowheads show lacunas formed by the adherens junction weakness (Scale bar = 100 µm). Permeability assay was performed by quantification of FITC-dextran (70 kDa) passage through a monolayer of not transfected or siRNA (LUC or IQGAP1) -transfected PDECs seeded in a Transwell®. The transfection with siIQGAP1 seems to increase the monolayer permeability (B). <i>PDECs</i>: untransfected cells; <i>siIQGAP1</i>: IQGAP1 siRNA-transfected cells; <i>siLUC</i>: Luciferase siRNA-transfected cells; <i>Dextran free</i>: serum free medium without dextran (negative control); <i>Dextran only</i>: dextran-FITC added to serum free medium without cells.</p

Total protein expression of IQGAP1, VE-cadherin and b-catenin in PDECs transfected or not with siRNA, before and after shear stress exposure.

<p>The total expression of IQGA1, VE-cadherin and β-catenin in non-transfected PDECs was investigated by western blot in static conditions (Ctr) and after 4 h and 8 h of shear stress, and quantified in comparison with the static condition (Ctr) (*p<0.05) (A). The same experiment was performed on siRNA (LUC or IQGAP1) transfected cells (**p<0.01 refer to comparison with siLUC conditions) (B).</p

PDECs align in the direction of flow under shear stress.

<p>(A) PDECs exposed to static or shear stress conditions (1.2 N/m²) were observed after fixation by optical microscopy. Cells not exposed to flow were used as control. Progressively, PDECs organized in a monolayer of contiguous cells, detached each other (arrows at 4 h) and aligned in the direction of flow (Scale bar: 100 µm). In lower panel, the actin cytoskeleton was labeled in PDECs exposed or not to shear stress, showing cortical actin and stress fiber formation within cells. (B) Cells direction has been quantified under static and shear stress conditions using the ImageJ software. The vertical axis and circular arcs corresponding to the standard error of mean (S.E.M.) and the horizontal axis representing the flow direction.</p

IQGAP1 is necessary for cell-cell adhesion and PDECs alignment.

<p>The IQGAP1 extinction rate has been evaluated by immunofluorescence staining of IQGAP1 and western blot before (not shown) and after 48 h of exposition to shear stress (scale bar: 10 µm) (A). PDECs were transfected with siRNA against IQGAP1 (siIQGAP1) or Luciferase (siLUC, control), exposed to shear stress for the indicated times (scale bar: 100 µm) and F-actin was stained with coupled-TRITC phalloïdine antibody (scale bar: 100 µm) (B). Angles of siLUC or siIQGAP1 transfected PDECs orientation under shear stress have been measured for 3 independent experiments and are represented in (C). The Rac1 activity has been quantified for PDECs transfected with siLUC or siIQGAP1 and maintained in static conditions or exposed to shear stress for 30 h and 48 h, showing the non Rac1 activation for siIQGAP1-transfected PDECs (D). Cell viability has been checked by Sulforhodamine test and cell number has been quantified in static conditions (control) and after 48 h of shear stress (E).</p