Molekulare Dosimetrie Platin-induzierter DNA-Läsionen

In der internistischen Onkologie gehören die Substanzen Cis- und Carboplatin seit Jahren zu den wirksamsten Zytostatika bei der Behandlung solider Tumoren. Die molekularen Mechanismen der therapeutischen Wirkungen und Nebenwirkungen dieser Verbindungen, sowie die Ursache(n) eines Therapieversagens sind multifaktoriell und in ihrer Komplexität bisher weitgehend unverstanden geblieben. Die Aufkärung dieser pharmakokinetischen und pharmakodynamischen Prozesse ist die Grundlage jeder chemoprotektiven bzw. resensitivierenden Intervention und damit des Fernziels einer individualisierten Chemotherapie. Die Einwirkung von Cis- bzw. Carboplatin auf die zelluläre DNA ist interindividuell und Zelltyp-spezifisch sehr unterschiedlich. Unter anderem kontrollieren die Nierenfunktion, der Wirkstoffimport- und -export über die Zellmembran, sowie zytoplasmatische Detoxifizierungsprozesse das Ausmaß der initialen Pt-DNA Adduktbildung. Ähnlich heterogen ist die Leistungsfähigkeit der zellulären DNA-Reparatursysteme und schließlich die Toleranz der Zellen gegenüber bestehenden Läsionen. Wie die klinische Bedeutung dieser Faktoren für eine primäre oder erworbene Platin-Resistenz zu bewerten ist, kann bislang nicht beantwortet werden. Im Rahmen klinisch realisierbarer Pt-Dosen ist die Möglichkeit, Tumorzellen zur Auslösung der Apoptose zu provozieren, wahrscheinlich das entscheidende Kriterium für ihre therapeutische Ansprechbarkeit. Bisher ist ungeklärt, welchen Anteil die einzelnen, strukturell verschiedenen Pt-DNA Addukte an diesem zytotoxischen Potential von Cis- und Carboplatin haben. Da Bildung und Elimination dieser Addukte im Zentrum des pharmakologischen Geschehens stehen, ist die Entwicklung einer hinreichend empfindlichen Methode zur quantitativen Bestimmung definierter Platin-DNA-Läsionen auf dem Niveau individueller Zellen, d. h. eine molekulare Dosimetrie, der erfolgversprechenste Weg zur Beantwortung der offenen Fragen. In dieser Arbeit wurden mit dem Ziel einer immunhistochemischen Einzelzell-Analytik monoklonale Antikörper gegen die verschiedenen Pt-DNA Addukte generiert und charakterisiert. Cisplatin-induzierte DNA Addukte sind in einen stereochemischen Kontext eingebunden, der offenbar weit über die koordinativen Bindungen der eigentlichen Läsion hinausreicht. Es konnte in diser Arbeit gezeigt werden, daß die Nachahmung dieser Raumordnung mit platinierten Oligonukleotiden nicht möglich ist. Daher führt der "klassische" Weg zur Generierung von spezifischen monoklonalen Antikörpern, d. h. die Immunisierung mit einem strukturell eindeutigen Antigen, nicht zum gewünschten Ziel. Aus diesem Grund wurde hier ein ganz neues Verfahren entwickelt: Die Immunaktivität der geimpften Tiere wurde mit platinierter DNA als Antigen zunächst gegen ein komplexes Epitopgemisch, d. h. gegen die Summe aller Addukte gerichtet. Anti-(Pt-DNA) positive Hybridome wurden nach der Fusion mit einem immunomagnetischen Separationsverfahren isoliert und kloniert. Zur Charakterisierung ihrer Epitop-Spezifität wurden in einem weiteren Schritt den so generierten MAK auf DNA-Fragmenten vereinzelte Pt-Addukte zur Bindung angeboten. Die vom jeweiligen Antikörper erkannten Epitope wurden dann über ein Festphasen-Adsorptionsverfahren isoliert und die Platin-Addukte mit Hilfe einer 32 P-Postlabelling- assozierten Radiochromatographie strukturell identifiziert. Weit über die Platinanalytik hinaus bietet das in dieser Arbeit erstmals entwickelte "retrospektive" Verfahren Zugang zu Strukturen, die von DNA-reaktiven Proteinen (wie z. B. Komponenten des DNA-Reparatursystems, von Faktoren der Genregulation oder von Strukturelementen der Chromatinarchitektur) im nativen Kontext erkannt und gebunden werden. Mit Hilfe dieser MAK wurde dann ein Immunfluoreszenz-Nachweisverfahren entwickelt, mit dem es möglich ist, die einzelnen Pt-DNA Addukte in den Kernen von Normal- oder Tumorzellen zu quantifizieren. Die Methode bedarf im Prinzip nur weniger Einzelzellen, so daß bereits erfolgreiche Pilot-Untersuchungen an Biopsien von Magentumorpatienten unter Cisplatin-Chemotherapie durchgeführt werden konnten. Bezogen auf den einzelnen Zellkern liegt die Nachweisempfindlichkeit für die einzelnen Pt-Addukte im Sub-Atomol Bereich (< 10 - 18 Mol) und erlaubt daher auch Messungen, die im zeitlichen Abstand von Wochen nach der Applikation vorgenommen werden. Cisplatin-Unempfindlichkeit von Tumoren kann vielfältige zellbiologische Ursachen haben, die in Zellkulturmodellen mit Paaren von sensitiven bzw. resistenten Zellen herausgetrennt aus der Komplexität eines Organismus analysiert werden können. In dieser Arbeit wurden humane Melanom- bzw. Ovarialkarzinomzellen untersucht, die sich in der Expression des ABC-Membrantransporters cMOAT unterschieden, der Cisplatin-Glutathionkomplexe aus der Zelle exportiert. Es konnte gezeigt werden, daß sich der Pt-Adduktgehalt in der genomischen DNA der Zellen umgekehrt proportional zur Expression und damit zur Aktivität der Membranpumpe verhielt. In den verschiedenen Zellen resultiert Äquitoxizität für Expositionskonzentrationen, welche gleiche Adduktspiegel induzieren. Auch die Platin-assoziertenellzyklusveränderungen zeigten sich als direkte Konsequenz der Pt-DNA Läsionen. Durch Transfektion mit cMOAT-Konstrukten oder anti-cMOAT-Ribozymen konnte die Cisplatin-Exportkapazität der Zellen, die Adduktbildung und damit die Toxizität verändert werden. Da der Nukleotid Exzisions Reparatur (NER) Weg als wichtigster Mechanismus in der Prozessierung von Pt-DNA Läsionen angesehen wird, wurde in dieser Arbeit ferner der Beitrag der "Schadens-Erkennungsproteine" XPA und XPC in entsprechenden murinen Knockout-Modellen untersucht. Verglichen mit den Wildtyp-Mäusen und XPC -- -Mäusen zeigten die XPA-Knockout Mäuse eine extreme Empfindlichkeit gegen Cisplatin. Durch die Messungen von in vivo Reparatur Kinetiken wurde zum ersten Mal demonstriert, daß die Hypersensitivität mit einer nahezu kompletten Inkompetenz der NER-defizienten Mäuse einhergeht, spezifische Pt-DNA Addukte wie Pt-GG Intrastrang Läsionen aus verschiedenen Zelltypen zu entfernen. DNA-Platinierungsprodukte werden durch XPA offensichtlich bereits auf der Stufe der frühen, intermediär auftretenden monovalenten Addukte prozessiert, so daß der funktionelle Ausfall zu einer exzessiven Bildung der bivalenten Intrastrang Addukte führt. Der erstaunlich gering Addukt-Gehalt in Lymphozyten, der in dieser Arbeit sowohl im Mausmodell wie auch in Patientenproben nachgewiesen wurde, beruht nicht auf der Fähigkeit dieser Zellen, solche frühen Eliminationen besonders effektiv zu realisieren: Obwohl der Addukt-Gehalt der XPA -- -Lymphozyten erwartungsgemäß höher lag als der bei NER-kompetenten Tieren, erreichten die Maxima nie das Ausmaß, das beispielsweise in Zellen von Niere oder Leber gefunden wurde. Deshalb muß ein anderer, noch unbekannter Mechanismus für die geringe Belastung der hämatopoetischen Zellen vermutet werden. In einer Pilotstudie wurden Magenkarzinom-Patienten Cisplatin-Therapie-begleitend auf die Bildung und Elimination spezifischer Pt- DNA Addukte untersucht. In peripheren Lymphozyten zeigte sich, daß der Pt-GG Gehalt über einen Zeitraum von 48 h nach Applikation kontinuierlich zunahm. Die Biopsien von Normal- und Tumorgeweben waren vor allem durch Zelltyp-spezifische Addukt-Belastung gekennzeichnet. Dieser Befund unterstreicht nachdrücklich die Notwendigkeit der Einzellanalytik. Schlußfolgerungen bezüglich der interindividuellen Unterschiede und der Aussagekraft der Messungen für den Therapieerfolg können aufgrund der ausstehenden Reihenuntersuchungen und Verlaufskontrollen bisher noch nicht formuliert werden. Diese Analysen sollen mittelfristig zur Klärung der Frage beitragen, welche Bedeutung Bildung und Elimination bzw. Persistenz spezifischer Pt-DNA-Addukte für den Erfolg oder das Versagen einer Tumortherapie mit Platin-Verbindungen haben und inwieweit an Lymphozyten erhobene Befunde repräsentativ auch für das Geschehen in anderen Zelltypen und besonders im Tumor sind. Außerdem wird es möglich sein, Cisplatin-synergistisch wirkende Substanzen wie z. B. Fludarabin, 5-Fluoruracil oder die Inhibitoren des EGF-Rezeptors bezüglich ihres Einflußes auf die Pt-DNA Addukte besser zu verstehen. Zusammenfassend läßt sich sagen, daß mit den in dieser Arbeit entwickelten Werkzeugen erstmals die genauen Wirkmechanismen der Platin-Zytostatika analytisch sind und damit molekulare Resistenzparameter in experimentellen Systemen und in klinischen Proben definiert werden können

Adduct-specific monoclonal antibodies for the measurement of cisplatin-induced DNA lesions in individual cell nuclei

The anticancer drug cisplatin executes its cytotoxic activity via formation of intra- and interstrand crosslinks in DNA. The relative contribution of structurally defined cisplatin adducts to induce apoptosis and the cellular processing of these lesions is still poorly understood mostly due to the lack of sensitive analytical tools for in vivo studies. Here we describe a new method to establish and characterize monoclonal antibodies (Mab) for structurally defined DNA adducts. The two major reaction products of cisplatin, the guanine–guanine (Pt-[GG]) and adenine–guanine (Pt-[AG]) intrastrand crosslinks are recognized by Mab R-C18 and R-B3, respectively. Both antibodies were employed in an immuno-cytological assay allowing the quantification of drug-induced lesions in individual cell nuclei at clinically relevant doses. Analyzing various tissues of cisplatin-treated C57Bl/6 mice the accumulation of Pt-(GG) was highest in kidney tubular cells compared with 30, 50 and 90% lower levels in kidney stroma, liver and peripheral blood cells, respectively. Adduct kinetics revealed that wild type mouse cells remove up to 80% of the crosslinks in contrast to their complete persistence in nucleotide excision repair-deficient (XPC(−/−)) mice. The aptitude of the immunoassay for human molecular dosimetry studies was demonstrated by measuring adduct levels in tumor biopsies from patients treated with cisplatin

A phase I dose-escalation study of the immunocytokine EMD 521873 (Selectikine) in patients with advanced solid tumours

n/

Erythropoietin overrides the triggering effect of DNA platination products in a mouse model of Cisplatin-induced neuropathy

<p>Abstract</p> <p>Background</p> <p>Cisplatin mediates its antineoplastic activity by formation of distinct DNA intrastrand cross links. The clinical efficacy and desirable dose escalations of cisplatin are restricted by the accumulation of DNA lesions in dorsal root ganglion (DRG) cells leading to sensory polyneuropathy (PNP). We investigated in a mouse model by which mechanism recombinant erythropoietin (rhEPO) protects the peripheral nervous system from structural and functional damage caused by cisplatin treatment with special emphasis on DNA damage burden.</p> <p>Results</p> <p>A cumulative dose of 16 mg cisplatin/kg resulted in clear electrophysiological signs of neuropathy, which were significantly attenuated by concomitant erythropoietin (cisplatin 32,48 m/s ± 1,68 m/s; cisplatin + rhEPO 49,66 m/s ± 1,26 m/s; control 55,01 m/s ± 1,88 m/s; p < 0,001). The co-application of rhEPO, however, did not alter the level of unrepaired cisplatin-DNA lesions accumulating in DRG target cells. Micro-morphological analyses of the sciatic nerve from cisplatin-exposed mice showed damaged myelin sheaths and mitochondria. Co-administered rhEPO inhibited myelin sheaths from structural injuries and resulted in an increased number of intact mitochondria.</p> <p>Conclusion</p> <p>The protective effect of recombinant erythropoietin is not mediated by reducing the burden of DNA platination in the target cells, but it is likely to be due to a higher resistance of the target cells to the adverse effect of DNA damage. The increased frequency of intact mitochondria might also contribute to this protective role.</p

Correlation between the dose of cisplatin (exposure: 2 h; 37°C) and the level of specific intrastrand crosslinks in the nuclear DNA of cultivated human Jurkat T cells

<p><b>Copyright information:</b></p><p>Taken from "Adduct-specific monoclonal antibodies for the measurement of cisplatin-induced DNA lesions in individual cell nuclei"</p><p>Nucleic Acids Research 2006;34(6):e47-e47.</p><p>Published online 29 Mar 2006</p><p>PMCID:PMC1420801.</p><p>© The Author 2006. Published by Oxford University Press. All rights reserved</p> Adduct levels were measured after immunostaining with anti-(Pt-DNA) Mab R-C18 (Pt-[GG] lesions (), or R-B3 specific for Pt-(AG) () and quantitative ICA image analysis (Materials and Methods). Antibody-derived signals from individual nuclei were normalized for the actual DNA content of each cell. Values are given as AFU and represent means ± SE of 200 analyzed cells per dose. Correlation: (A) = 0.96; (B) = 0.91

Radio-chromatographic analysis of the relative amounts of Pt-(GG) and Pt-(AG) intrastrand crosslinks in DNA preparations Pt 1–3 without antibody selection () or after the immuno-trapping procedure with Mab R-B3 (), Mab R-C7 () or Mab R-C18 ()

<p><b>Copyright information:</b></p><p>Taken from "Adduct-specific monoclonal antibodies for the measurement of cisplatin-induced DNA lesions in individual cell nuclei"</p><p>Nucleic Acids Research 2006;34(6):e47-e47.</p><p>Published online 29 Mar 2006</p><p>PMCID:PMC1420801.</p><p>© The Author 2006. Published by Oxford University Press. All rights reserved</p> The -axes represent the P-derived radioactive signals (c.p.m.), the -axes give the elution time (min)

Efficacy and Safety of Proposed Biosimilar Natalizumab (PB006) in Patients With Relapsing-Remitting Multiple Sclerosis The Antelope Phase 3 Randomized Clinical Trial

IMPORTANCE Proposed biosimilar natalizumab (biosim-NTZ) PB006 is the first biosimilar monoclonal antibody therapy developed for multiple sclerosis (MS) treatment. OBJECTIVE To evaluate matching efficacy, safety, and immunogenicity between biosim-NTZ and reference natalizumab (ref-NTZ) in patients with relapsing-remitting MS (RRMS). DESIGN, SETTING, AND PARTICIPANTS The Antelope trial was a phase 3, parallel-group, randomized, active-controlled study, conducted between October 2019 and March 2021, with last patient follow-up visit on August 23, 2021. The study took place in 48 centers in 7 countries. Of 531 patients with RRMS aged 18 to 60 years screened, 266 were excluded before randomization in line with study criteria. Eligible participants had 1 or more documented relapse within the previous year and either 1 or more gadolinium-enhancing T1-weighted or 9 or more T2-weighted brain lesions, Kurtzke Expanded Disability Status Scale score of 0 to 5.0 (inclusive), and John Cunningham virus index of 1.5 or less at screening. One patient withdrew consent before dosing. INTERVENTIONS Intravenous infusions every 4 weeks of biosim-NTZ, 300 mg, or ref-NTZ, 300 mg (1:1 randomization), from week 0 to week 44 (end-of-study visit: week 48). At week 24, the ref-NTZ group was rerandomized and 30 patients were switched to biosim-NTZ for the remainder of the study. MAIN OUTCOMES AND MEASURES The primary end point was the cumulative number of new active lesions on magnetic resonance imaging (new gadolinium-enhancing T1-weighted lesions and new/enlarging T2-weighted lesions without double counting) over 24 weeks. Additional end points included further magnetic resonance imaging parameters, annualized relapse rate, and Kurtzke Expanded Disability Status Scale score. Safety, tolerability, and immunogenicity assessments included adverse events, laboratory evaluations, and positivity for anti-John Cunningham virus antibodies and antinatalizumab antibodies. RESULTS A total of 264 participants (mean [SD] age, 36.7 [9.38] years;162 [61.4%] female) received treatment with biosim-NTZ (n = 131) or ref-NTZ (n = 133). At week 24, the model-based mean difference in cumulative number of new active lesions between biosim-NTZ and ref-NTZ treatment groups was 0.17 (least square means [SE]: biosim-NTZ, 0.34 [0.34];ref-NTZ, 0.45 [0.28];95% CI, -0.61 to 0.94 within the prespecified margins of +/- 2.1). No significant differences between treatment groups were observed across secondary efficacy end points, safety, tolerability, or immunogenicity assessments. CONCLUSIONS AND RELEVANCE Biosim-NTZ matched ref-NTZ in efficacy, safety, and immunogenicity for patients with RRMS in the tested setting. This phase 3 trial supports proposed biosim-NTZ as a biosimilar alternative to ref-NTZ for treating RRMS

Repair capacity for Platinum-DNA adducts determines the severity of cisplatin-induced peripheral neuropathy

The pronounced neurotoxicity of the potent antitumor drug cisplatin frequently results in the onset of peripheral polyneuropathy ( PNP), which is assumed to be initially triggered by platination products in the nuclear DNA of affected tissues. To further elucidate the molecular mechanisms, we analyzed in a mouse model the formation and processing of the main cisplatin-induced DNA adduct ( guanine-guanine intrastrand cross-link) in distinct neuronal cell types by adduct-specific monoclonal antibodies. Comparison of the adduct kinetics in cisplatin-injected mice either proficient or deficient for nucleotide excision repair ( NER) functions revealed the essential role of this DNA repair pathway in protecting differentiated cells of the nervous system from excessive formation of such lesions. Hence, chronic exposure to cisplatin resulted in an accelerated accumulation of unrepaired intrastrand cross-links in neuronal cells of mice with dysfunctional NER. The augmented adduct levels in dorsal root ganglion ( DRG) cells of those animals coincided with an earlier onset of PNP-like functional disturbance of their sensory nervous system. Independently from the respective repair phenotype, the amount of persisting DNA cross-links in DRG neurons at a given cumulative dose was significantly correlated to the degree of sensory impairment as measured by electroneurography. Collectively, these findings suggest a new model for the processing of cisplatin adducts in primary neuronal cells and accentuate the crucial role of effectual DNA repair capacity in the target cells for the individual risk of therapy-induced PNP