Avaliação do estresse oxidativo em Leptodactylus latrans (Steffen, 1815) de lavouras de arroz irrigado, no sul de Santa Catarina, Brasil

Trabalho de Conclusão de Curso, apresentado para a obtenção do grau de Bacharel no curso de Ciências Biológicas da Universidade do Extremo Sul Catarinense, UNESC.Os anfíbios são muito susceptíveis a danos provocados por agrotóxicos, pelo fato deste grupo viver o maior tempo de sua vida em ambientes aquáticos e a sua pele ser altamente permeável e muito sensível a produtos químicos. Estudos mostram que ovos e larvas de anfíbios têm se revelado extremamente sensíveis aos efeitos dos metais e da poluição. Os agrotóxicos parecem contribuir para o estresse oxidativo em modelos animais. As espécies reativas de oxigênio (EROs) podem ser produzidas nos organismos, por fontes exógenas como a radiação, os agrotóxicos e a poluição ambiental. Deste modo, o objetivo do trabalho foi avaliar a ocorrência de estresse oxidativo em diferentes tecidos (pulmão, fígado, rins e músculo) de Leptodactylus latrans em lavoura de arroz com uso de agrotóxicos, comparando com áreas controles, bem como os tecidos que mais sofreram estresse oxidativo. As capturas dos animais foram realizadas em quatro áreas: plantação de arroz irrigado com uso de agrotóxico Treze de Maio, Santa Catarina (grupo teste) e em três áreas úmidas de restinga da planície costeira do sul de Santa Catarina (grupo controle). Foram capturados machos e fêmeas entre 30 e 60 gramas e retiradas às estruturas para análises de estresse oxidativo em lipídeos (TBARS) e proteínas (Carbonil). Dosagens de enzimas superóxido dismutase (SOD) e catalase (CAT) foram realizadas. A espécie L. latrans foi analisada no todo (machos e fêmeas) e animais machos foram separados nos testes estatísticos (teste t student), sendo valor de p< 0,05 considerado significativamente estatístico. Ocorreu um aumento significativo nos níveis de TBARS de animais expostos aos agrotóxicos nos tecidos renal e muscular; quando separados animais machos foi observado também no tecido pulmonar. Níveis de Carbonil não foram significativos em animais expostos aos agrotóxicos quando comparados ao grupo controle, apesar da tendência ao aumento. A atividade de SOD diminuiu no tecido renal de animais expostos aos agrotóxicos e tecidos renal e muscular quando foram separados animais machos do mesmo grupo. A atividade de CAT aumentou no tecido hepático de animais expostos aos agrotóxicos. Os resultados do presente estudo oferecem dados sobre o estresse oxidativo ocorridos em pelo menos dois tecidos da espécie Leptodactylus latrans em áreas de lavouras de arroz contaminadas pelo uso de agrotóxico, bem como a diferença dos efeitos oxidativos em animais machos. O tecido hepático se mostrou adaptado ao estresse oxidativo, mostrando que tecidos diferem no que diz respeito à capacidade de defesa contra o estresse oxidativo induzido por poluentes. Leptodactylus latrans mostra-se um bom bioindicador de impacto ambiental provocado por agrotóxicos e água contaminada

Estudo dos mecanismos moleculares envolvidos no efeito citoprotetor de compostos orgânicos de selênio em células neuronais e endoteliais

Tese (doutorado) - Universidade Federal de Santa Catarina, Centro de Ciências Biológicas, Programa de Pós-Graduação em Bioquímica, Florianópolis, 2020.Estudos mostram que o dano oxidativo está associado à patofisiologia de doenças cardiovasculares e neurodegenerativas. Sendo assim, a procura por fármacos que atuam aumentando a expressão de defesas antioxidantes, e consequentemente diminuem o dano oxidativo, tem ganhado grande ênfase nas últimas décadas. Neste sentido, compostos orgânicos de selênio, como o disseleneto de difenila (PhSe)2, apresentam propriedades antioxidantes em modelos experimentais de doenças cardiovasculares e neurodegenerativas. O efeito antioxidante de compostos orgânicos de selênio tem sido atribuído primeiramente a sua ação tiol-peroxidase semelhante à enzima glutationa peroxidase (GPx). Porém os mecanismos biológicos destes compostos parecem ser mais complexos e ainda não foram completamente compreendidos. Além disso, ainda não foi descrito o efeito antioxidante destes compostos em protocolos glicolíticos ou oxidativos celulares. Esta tese primeiramente objetivou caracterizar o perfil metabólico de células endoteliais de aorta bovina (BAEC) mantidas em meio contendo glicose (protocolo glicolítico) ou galactose (protocolo oxidativo). BAEC mantidas em meio contendo glicose apresentaram diminuição da capacidade de reserva respiratória, aumento da fissão mitocondrial, da variabilidade intracelular e maior expressão de Nrf2 em comparação a células mantidas em meio contendo galactose. Em relação ao efeito do (PhSe)2, este composto foi capaz de aumentar a respiração celular, diminuir a fissão mitocondrial, o volume de mitocôndrias na região perinuclear e aumentar a movimentação de mitocôndrias (esquerda/direita) em BAEC mantidas em meio glicolítico. Estes efeitos não foram encontrados em BAEC mantidas em protocolo oxidativo. O tratamento de BAEC com (PhSe)2 foi capaz de prevenir a produção de espécies reativas (ER) mitocondriais provocadas por oxidantes, nos dois protocolos experimentais. Esta prevenção foi relacionada à capacidade do (PhSe)2 em aumentar a expressão de enzimas antioxidantes ativadas por Nrf2. Em protocolo glicolítico, o (PhSe)2 inativa FOXO3, em parte via ativação da Akt. Em contrapartida, no protocolo oxidativo, o (PhSe)2 parece ativar FOXO3 em 24h de incubação, contudo esta ativação não está relacionada à via da Akt em BAEC. Além disso, esta tese buscou avaliar o efeito citoprotetor de novos compostos orgânicos de selênio, protótipos do (PhSe)2, a fim de obter alternativas farmacológicas úteis para o tratamento de doenças. Sendo assim, inicialmente foi avaliada a atividade tiol peroxidase e oxidase dos compostos (PhSe)2, PhSeZnCl, MRK-Picolyl e MRK-Ester comparando com a enzima GPx. Como esperado, a GPx possui alta atividade tiol peroxidase e baixa tiol oxidase em comparação a todos os compostos testados. Foram observados efeitos protetores destes compostos contra desafios oxidativos induzidos por glutamato ou SIN-1 em células neuronais HT22. O tratamento com (PhSe)2 em HT22 também foi capaz de aumentar a expressão de enzimas antioxidantes. Sendo assim, a capacidade em oxidar os grupamentos tióis de proteínas e modular vias de transcrição relacionadas a defesas antioxidantes pode ser uma alternativa farmacológica desempenhada por estes compostos em BAEC e HT22. Apesar do mecanismo de proteção exato dos compostos orgânicos de selênio, não ter sido determinado, várias informações importantes acerca de seus efeitos foram aqui reveladas. Estas informações poderão direcionar estudos futuros para melhor compreender o potencial farmacológico destes compostos.Abstract: The oxidative damage is associated with the pathophysiology of cardiovascular and neurodegenerative diseases. Thus, the studies for drugs that act by increasing the expression of antioxidant defenses, and consequently decrease oxidative damage, has gained great emphasis in recent decades. In this context, organoselenium compound, such as diphenyl diselenide (PhSe)2, showed antioxidant properties in experimental models on cardiovascular and neurodegenerative diseases. The antioxidant effect of organoselenium compounds has been primarily attributed to its thiol-peroxidase action similar to the enzyme glutathione peroxidase (GPx). However, the biological mechanisms of organoselenium compounds is complex and has not yet been fully understood. In addition, the antioxidant effect of organoselenium compounds in glycolytic or oxidative protocols has not yet been described. This thesis first aimed to characterize the metabolic profile of bovine aorta endothelial cells (BAEC) maintained in a medium containing glucose (glycolytic protocol) or galactose (oxidative protocol). The BAEC maintained in glucose-containing medium showed decreased respiratory reserve capacity, increased mitochondrial fission, intracellular variability and increased the expression of Nrf2 when compared to cells maintained in galactose-containing medium. Regarding the effect of (PhSe)2, this compound is able to increase cellular respiration, decrease mitochondrial fission, the volume of mitochondrial in the perinuclear region and increase the movement of mitochondrial (left/right) in BAEC maintained in glycolytic medium. These effects are not found in BAEC maintained in oxidative protocol. The treatment of BAEC with (PhSe)2 was able to prevent the production of mitochondrial reactive species (RS) caused by oxidants, in both experimental protocols. This prevention is related to the ability of (PhSe)2 to increase the expression of antioxidant enzymes activated by Nrf2. In glycolytic protocol, the (PhSe)2 inactivates FOXO3 in part, via Akt activation. In contrast, in oxidative protocol, the (PhSe)2 seems to activate FOXO3 at 24h of incubation, however this activation is not related to the Akt pathway in BAEC. The third chapter of this thesis aimed to evaluate the cytoprotective effect of new organoselenium compounds, prototypes of (PhSe)2, in order to obtain useful pharmacological alternatives for the treatment of diseases. Therefore, initially was compared the thiol peroxidase and oxidase activity of the compounds (PhSe)2, PhSeZlCl, MRK-Picolyl and MRK-Ester with the GPx enzyme. As expected, the GPx enzyme has high thiol peroxidase activity and low thiol oxidase compared to all tested organoselenium compounds. However, protective effects of organoselenium compounds have been observed against oxidative challenges induced by glutamate or SIN-1 in HT22 neuronal cells. The treatment with (PhSe)2 in HT22 is also able to increase the expression of antioxidant enzymes. Thus, the ability to oxidize thiol groups of proteins and modulate transcription pathways related to antioxidant defenses may be a pharmacological alternative performed by organoselenium compounds in BAEC and HT22. Although the exact protection mechanism of organoselenium compounds has not been determined, several important information about their effect has been revealed here. This information may guide futures studies to better understand the pharmacological potential of organoselenium compounds

The thiol-modifier effects of organoselenium compounds and their cytoprotective actions in neuronal cells

Most pharmacological studies concerning the beneficial effects of organoselenium compounds have focused on their ability to mimic glutathione peroxidase (GPx). However, mechanisms other than GPx-like activity might be involved on their biological effects. This study was aimed to investigate and compare the protective effects of two well known [(PhSe)2 and PhSeZnCl] and two newly developed (MRK Picolyl and MRK Ester) organoselenium compounds against oxidative challenge in cultured neuronal HT22 cells. The thiol peroxidase and oxidase activities were performed using the glutathione reductase (GR)-coupled assay. In order to evaluate protective effects of the organoselenium compounds against oxidative challenge in neuronal HT22 cells, experiments based on glutamate-induced oxytosis and SIN-1-mediated peroxynitrite generation were performed. The thiol peroxidase activities of the studied organoselenium compounds were smaller than bovine erythrocytes GPx enzyme. Besides, (PhSe)2 and PhSeZnCl showed higher thiol peroxidase and lower thiol oxidase activities compared to the new compounds. MRK Picolyl and MRK Ester, which showed lower thiol peroxidase activity, showed higher thiol oxidase activity. Both pre- or co-treatment with (PhSe)2, PhSeZnCl, MRK Picolyl and MRK Ester protected HT22 cells against glutamate-induced cytotoxicity. (PhSe)2 and MRK Picolyl significantly prevented peroxinitrite-induced dihydrorhodamine oxidation, but this effect was observed only when HT22 were pre-treated with these compounds. The treatment with (PhSe)2 increased the protein expression of antioxidant defences (Prx3, CAT and GCLC) in HT22 cells. Taking together, our results suggest that the biological effects elicited by these compounds are not directly related to their GPx-mimetic and thiol oxidase activities, but might be linked to the up-regulation of endogenous antioxidant defences trough their thiol-modifier effects