Theoretische und experimentelle Methoden zur Verbesserung der Unterscheidbarkeit alternativer Modelle der Proteinrekrutierung

Die Möglichkeit zur fluoreszenten Markierung von Proteinen ist eine der herausragendsten Entwicklungen der Biologie in den letzten Jahrzehnten. Hierdurch ist es möglich, zuvor ungeahnte Einblicke in die fundamentalen Abläufe des Lebens, etwa der Zellvermehrung, der DNA-Reparatur und der Kommunikation mit anderen Zellen, zu gewinnen. Um aus den Daten von Experimenten mit fluoreszierenden Proteinen die chemischen Ratenkonstanten und weiterführende Informationen zu gewinnen, werden standardmäßig mathematische Modelle verwendet. Für ein gegebenes Experiment bieten sich dabei zumeist mehrere miteinander konkurrierende Modelle an. Um in einer derartigen Untersuchung letztlich zu aussagekräftigen Ergebnissen zu gelangen, ist es entscheidend, dass zwischen den Modellen anhand ihrer Fähigkeit zur Reproduktion der Daten unterschieden werden kann. Allerdings ist diese Unterscheidbarkeit häufig aufgrund der mangelnden Spezifität der experimentellen Daten oder der zu hohen Anpassungsfähigkeit der Modelle an die Daten nicht gegeben. Da die Unterscheidbarkeit zwischen alternativen Modellen derart bedeutend für den Erkenntnisgewinn aus einer Untersuchung ist, befasst sich diese Arbeit daher mit verschiedenen, sowohl theoretischen als auch experimentellen Methoden, mit denen die Unterscheidbarkeit zwischen Modellen erhöht werden kann. Dabei werden solche Modelle untersucht, die der Beschreibung der Proteinrekrutierung innerhalb einer Zelle nach einem auslösenden Ereignis, wie etwa nach DNA-Schäden erzeugender Bestrahlung mit einem Laser, dienen. Im ersten Teil wird auf rein theoretischer Basis eine Methode entwickelt, die auf dem Vergleich spezifischer Merkmale von Proteinrekrutierungskurven aufbaut. Diese Methode soll unter anderem Experimentatoren dabei helfen, anhand ihnen vorliegender experimenteller Daten eine Vorauswahl der zur Datenanalyse verwendeten Modelle zu treffen und hierdurch den Arbeitsaufwand der Datenanalyse zu reduzieren. Zusätzlich können die Erkenntnisse aus dem ersten Teil auch bei der Planung eines Experiments sehr hilfreich sein, da sie Aufschluss darüber geben, welche Zeitfenster während der Proteinrekrutierung für die Identifizierung oder den Ausschluss eines bestimmten Modells ausschlaggebend sind. Im zweiten Teil der Arbeit wird eine Methode vorgestellt, die auf der Verwendung von FRAP (Fluorescence Recovery after Photobleaching) zu unterschiedlichen Zeitpunkten während der Proteinrekrutierung basiert. FRAP ist eine Standardmethode, die unter anderem der Untersuchung der chemischen Ratenkonstanten der Proteine dient. In der hier vorgestellten Weiterentwicklung der FRAP-Methode werden zwei Laser verwendet, wobei der erste Laser der Erzeugung von DNA-Schäden dient und der Zweite dem Bleichen der fluoreszierenden Proteine. Dies führt zum einen zu einer deutlichen Verbesserung der Unterscheidbarkeit der Modelle. Zum anderen ist es dank dieser Methode auch möglich, Prozesse zu untersuchen, während deren Dauer sich die chemischen Ratenkonstanten der Proteine ändern. Hierdurch unterscheidet sich die hier vorgestellte Methode wesentlich von klassischen FRAP-Analysen und ermöglicht damit die Untersuchung von noch unerforschten, aus wissenschaftlicher Sicht sehr interessanten Abläufen. Der dritte Teil dieser Arbeit untersucht auf rein theoretischer Basis den Einfluss des zeitlichen Abstandes zwischen der Bestrahlung zur Erzeugung von DNA-Schäden und der Verwendung des zweiten Lasers zum Bleichen der Proteine. Diese Untersuchung kommt zu dem Schluss, dass eine Kombination verschiedener zeitlicher Abstände die Unterscheidbarkeit der alternativen Modelle deutlich verbessert. Die für zukünftige Experimente entscheidende Botschaft dieser Arbeit besteht zusammenfassend in der Aussage, dass die Durchführung von FRAP-Experimenten zu unterschiedlichen Zeitpunkten während der Proteinrekrutierungskurve die Unterscheidbarkeit zwischen alternativen Modellen und damit die Wahrscheinlichkeit für aussagekräftige Ergebnisse wesentlich erhöht

Deducing Underlying Mechanisms from Protein Recruitment Data

<div><p>By using fluorescent labelling techniques, the distribution and dynamics of proteins can be measured within living cells, allowing to study in vivo the response of cells to a triggering event, such as DNA damage. In order to evaluate the reaction rate constants and to identify the proteins and reactions that are essential for the investigated process, mechanistic models are used, which often contain many proteins and associated parameters and are therefore underdetermined by the data. In order to establish criteria for assessing the significance of a model, we present here a systematic investigation of the information that can be reliably deduced from protein recruitment data, assuming that the complete set of reactions that affect the data of the considered protein species is not known. To this purpose, we study in detail models where one or two proteins that influence each other are recruited to a substrate. We show that in many cases the kind of interaction between the proteins can be deduced by analyzing the shape of the recruitment curves of one protein. Furthermore, we discuss in general in which cases it is possible to discriminate between different models and in which cases it is impossible based on the data. Finally, we argue that if different models fit experimental data equally well, conducting experiments with different protein concentrations would allow discrimination between the alternative models in many cases.</p></div

Model in which protein decreases the dissociation rate of protein .

<p>A) , from bottom to top curve, , . Grey curves: Fits of the model in which protein decreases the association rate of protein . Orange curves: Monoexponential fit with an intercept. Decreasing leads to a new feature, which is characterized by a decline of the slope followed by an increase. Since this feature can not occur in the model in which protein decreases the association rate, it allows distinguishing between the model in which protein decreases the association rate and the model in which it decreases the dissociation rate. B) same parameters as in subfigure A, but from bottom to top and . Despite of the variation in , the time at which the bend occurs is the same for all curves.</p

Comparison of the models.

<p>Comparison of the models.</p

Model in which protein decreases the association rate of protein . and from bottom to top curve.

<p>A) . Solid lines are for protein , the dotted line is for protein . The grey line is a monoexponential fit. The dashed lines are used for estimating the rate constants from the curves, giving . After has risen to a high level, recruitment of becomes much slower, and the slope of the recruitment curve of (purple curve) decreases faster than would be expected from a monoexponential curve that has a similar initial slope (grey curve). B) same parameters as in A) except . The curves always resemble a monoexponential function.</p

Model in which protein increases the dissociation rate of . , from green to blue curve, and .

<p>Grey curves: Fits of the model in which protein decreases the association rate of and in which dissociation is relevant (section B1.3).</p

Model in which decreases the association rate of and in which dissociation is relevant. and from green to blue curve; and .

<p>The curves are normalized to their asymptotic value at . In contrast to the previous models, the recruitment curves of this model have a maximum that is larger than the plateau value if and .</p

Model in which protein increases the association rate of protein . and from bottom to top curve.

<p>A) . Solid lines are for protein , the dotted line is for protein , and the dashed lines are used for estimating the order of magnitude of the rate constants from the curves, giving for the steepest curve, and and for the slowest curve. Depending on the parameters the curves show an increasing slope at the beginning. B) same parameters as in A) except . The curves always show an increasing slope at the beginning, which helps distinguishing this case from the one shown in <a href="http://www.plosone.org/article/info:doi/10.1371/journal.pone.0066590#pone-0066590-g002" target="_blank">Figure 2A</a>. Additionally, for large values of the recruitment curves of resemble the recruitment curve of , which is not the case if .</p

Discrimination of Kinetic Models by a Combination of Microirradiation and Fluorescence Photobleaching

AbstractFluorescence recovery after photobleaching (FRAP) is an excellent tool to measure the chemical rate constants of fluorescently labeled proteins in living cells. Usually FRAP experiments are conducted with the protein concentrations being in a steady state, i.e., when the association and dissociation of the proteins are equilibrated. This is a strong limitation because situations in which rate constants change with time are of great scientific interest. In this study, we present an approach in which FRAP is used shortly after DNA damage introducing laser microirradiation, which results in the recruitment of the DNA clamp protein proliferating cell nuclear antigen (PCNA) to DNA lesions. We establish different kinetic models that are compatible with the observed PCNA recruitment data if FRAP is not used. By using FRAP at different time points during protein accumulation, we can not only exclude two out of three models, but we can also determine the rate constants with increased reliability. This study thus demonstrates the feasibility of using FRAP during protein recruitment and its application in the discrimination of possible kinetic models