Expresión de anticuerpos recombinantes de un solo dominio de llama (Lama glama) y análisis de su capacidad neutralizante de la actividad hemorrágica de una fracción del veneno de la serpiente Bothrops atrox

Expresa y purifica anticuerpos recombinantes de un solo dominio de llama (Lama glama) en Escherichia coli y evaluar su capacidad para neutralizar la actividad hemorrágica de una fracción pesada del veneno de la serpiente peruana Bothrops atrox, en ratones de laboratorio. Se analizaron 18 Nb expresados y purificados en E. coli para determinar su capacidad neutralizante de la actividad hemorrágica empleando ratones de laboratorio. Para esto se realizó un fraccionamiento del veneno de serpiente Bothrops atrox por cromatografía de exclusión molecular sobre resina Sephadex G-100 y se seleccionó una fracción de alto peso molecular con actividad hemorrágica. Se evaluó la dosis hemorrágica mínima (DHM) en el veneno crudo (0.810 μg) y en la fracción (0.433 μg) la cual representó 1.87 veces superior a la del veneno crudo; luego se evaluó la dosis eficaz 50% (DE 50) para cada Nb usando como dosis reto 4 DHM. Se encontró que 6 Nb tienen capacidad neutralizante además uno de ellos tiene una dosis eficaz 50% contra el efecto hemorrágico muy efectivo de 2247 μL de antiveneno/mg de veneno. También se evaluó la neutralización de la citotoxicidad de algunos Nb. Se concluye que algunos de los anticuerpos recombinantes de un solo dominio de llama (Lama glama) obtenidos en este estudio, son capaces de neutralizar la actividad hemorrágica de una fracción del veneno de la serpiente peruana B. atrox. Hay Nb que pueden ser usados para la formulación de un antídoto recombinante efectivo y económico.Tesi

Development of nanobodies against hemorrhagic and myotoxic components of Bothrops atrox snake venom

Snake envenoming is a globally neglected public health problem. Antivenoms produced using animal hyperimmune plasma remain the standard therapy for snakebites. Although effective against systemic effects, conventional antivenoms have limited efficacy against local tissue damage. In addition, potential hypersensitivity reactions, high costs for animal maintenance, and difficulties in obtaining batch-to-batch homogeneity are some of the factors that have motivated the search for innovative and improved therapeutic products against such envenoming. In this study, we have developed a set of nanobodies (recombinant single-domain antigen-binding fragments from camelid heavy chain-only antibodies) against Bothrops atrox snake venom hemorrhagic and myotoxic components. An immune library was constructed after immunizing a Lama glama with whole venom of B. atrox, from which nanobodies were selected by phage display using partially purified hemorrhagic and myotoxic proteins. Biopanning selections retrieved 18 and eight different nanobodies against the hemorrhagic and the myotoxic proteins, respectively. In vivo assays in mice showed that five nanobodies inhibited the hemorrhagic activity of the proteins; three neutralized the hemorrhagic activity of whole B. atrox venom, while four nanobodies inhibited the myotoxic protein. A mixture of the anti-hemorrhagic and anti-myotoxic nanobodies neutralized the local tissue hemorrhage and myonecrosis induced by the whole venom, although the nanobody mixture failed to prevent the venom lethality. Nevertheless, our results demonstrate the efficacy and usefulness of these nanobodies to neutralize important pathologies of the venom, highlighting their potential as innovative therapeutic agents against envenoming by B. atrox, a viperid species causing many casualties in South America.National Council of Science and Technology/[188-2015-FONDECYT]/CONCYTEC-FONDECYT/PerúUCR::Vicerrectoría de Investigación::Unidades de Investigación::Ciencias de la Salud::Instituto Clodomiro Picado (ICP