Regulação da embriogênese somática de araucaria angustifolia (Bert) O. kuntze pelo mecanismo redox

TCC (graduação em Agronomia) - Universidade Federal de Santa Catarina, Centro de Ciências Agrárias, 2011A Araucaria angustifolia é uma conífera subtropical nativa do Brasil. A sua intensa exploração nas ultimas décadas a levou a uma categoria de ameaça como espécie em perigo crítico de extinção pela IUCN. Assim, estratégias de conservação são requeridas, dentre elas destaca-se a possibilidade de emprego da embriogênese somática, como ferramenta biotecnológica para a multiplicação em massa. O protocolo de embriogênese somática para essa espécie encontra-se parcialmente desenvolvido junto ao Laboratório de Fisiologia do Desenvolvimento e Genética Vegetal do CCA/UFSC, sendo seu limitante o processo de maturação das culturas embriogênicas. Em outras espécies, foram descritas melhores taxas de formação e maturação de pró-embriões e embriões viáveis por meio da suplementação do meio de cultura com glutationa reduzida (GSH). Sabe-se também que o óxido nítrico (NO) atua como sinalizador em processos como a germinação de sementes e divisão celular, sendo, no caso da A. angustifolia, possivelmente, um dos responsáveis pela polarização dos pró-embriões. Dessa forma, o presente trabalho visou avaliar a influência da suplementação do meio de cultura semi sólido e suspensão celular de pré-maturação de culturas embriogênicas de A. angustifolia com glutationa reduzida (0,01; 0,1; 1; 5 mM), glutationa dissulfeto (0,1 mM) e butionina sulfoximina (0,1 mM) no conteúdo endógeno de NO, no NO extracelular liberado ao meio de cultura, nas características morfológicas, no conteúdo endógeno de poliaminas (PA) e no processo de maturação dos embriões somáticos. A suplementação dos meios de cultura de pré-maturação com GSH apresentou influência direta no conteúdo endógeno de NO e no desenvolvimento dos pró-embriões de A. angustifolia. Destacando os tratamentos com GSH (0,01 e 0,1 mM), que resultaram em um aumento de pelo menos 4x no número de pró-embriões formados. O tratamento com 5 mM de GSH na pré-maturação resultou na formação de embriões globulares com alto conteúdo endógeno de NO no ápice embrionário. No entanto, as culturas embriogênicas resultaram na formação de embriões torpedo anormais quando submetidas à maturaçã

Desenvolvimento de um protocolo de isolamento de cloroplastos e DNA plastidial em coníferas e sequenciamento do genoma plastidial de Podocarpus lambertii Klotzch ex Endl.

Dissertação (mestrado) - Universidade Federal de Santa Catarina, Centro de Ciências Agrárias, Programa de Pós-Graduação em Recursos Genéticos Vegetais, Florianópolis, 2014.O sequenciamento do genoma plastidial de coníferas vem sendo realizado por meio do isolamento do DNA total, seguido por amplificações do DNA plastidial através de PCR de longo alcance. Esse método de sequenciamento é mais trabalhoso do que o sequenciamento a partir DNA plastidial. O sequenciamento do genoma plastidial permite a realização de várias análises comparativas, como estudos filogenéticos, filogeografia, evolução e estrutura, localização de regiões repetidas, identificação de sítios de edição de RNA, entre outras. Dessa forma, o presente trabalho visou desenvolver um protocolo de isolamento de cloroplastos e DNA plastidial em coníferas e sequenciar o genoma plastidial do Podocarpus lambertii. O protocolo foi desenvolvido a partir da Araucaria angustifolia e Araucaria bidwilli (Araucariaceae), P. lambertii (Podocarpaceae) e Pinus patula (Pinaceae). O protocolo se baseia no isolamento plastidial a partir de um tampão salino, seguido por gradiente salino de Percoll. Essas duas estratégias combinadas, reduziram a contaminação e aumentaram o rendimento do DNA plastidial. O DNA plastidial foi sequenciado em sequenciador Illumina MiSeq, obtendo-se uma cobertura média do genoma de: 24,63 para A. angustifolia, 135,97 para A. bidwilli, 1196,10 para P. lambertii e 64,68 para P. patula. O genoma plastidial do P. lambertii é formado por 133.734 pb e apresentou a perda de uma das regiões invertidas repetidas. O genoma contém 118 genes únicos e 1 tRNA duplicado (trnN-GUU). Estruturalmente, o genoma plastidial do P. lambertii apresenta quatro grandes inversões de aproximadamente 20.000 pb quando comparado ao Podocarpus totara. O genoma plastidial do P. lambertii apresenta um total de 28 repetições em tandem e 156 simple sequence repeat (SSRs). Os resultados obtidos são inovadores uma vez que um protocolo viável para o isolamento de DNA plastidial de coníferas com alta qualidade e quantidade de DNA foi obtido. Adicionalmente, a sequência do genoma plastidial do P. lambertii revelou diferenças estruturais significativas, mesmo em relação à outra espécie do mesmo gênero. Os diversos SSRs encontrados no genoma plastidial do P. lambertii podem ser avaliados como regiões polimórficas intraespecíficas, que podem levar, entre outros, a estudos filogenéticos com maior sensibilidade.Abstract : Plastid genome sequencing protocols for conifer species have been based mainly on long-range PCR, which is known to be time-consuming and difficult to implement than sequencing from isolated plastid DNA. Plastid genome sequencing are useful for several comparative analyzes, as phylogeny, phylogeography, evolution and structure, location of repeated regions, identification of RNA editing sites, among others. Thus, this study aimed to develop a protocol for chloroplast and plastid DNA isolation in conifers and sequence the chloroplast genome of Podocarpus lambertii. The protocol was developed using Araucaria angustifolia and Araucaria bidwilli (Araucariaceae), P. lambertii (Podocarpaceae) and Pinus patula (Pinaceae) species. The protocol is based on plastid isolation with saline buffer followed by saline Percoll gradient. These two combined strategies reduced contamination and increased the plastid DNA yield. The plastid DNA was sequenced in MiSeq Illumina sequencer, and the average genome coverage were 24.63 to A. angustifolia, 135.97 to A. bidwilli, 1196.10 to P. lambertii, and 64.68 to P. patula. The chloroplast genome of P. lambertii is 133.734 bp in length and lacks one of the inverted repeat regions. The genome contains 118 unique genes and one duplicated gene, the tRNA (trnN-GUU). Structurally, the plastid genome of P. lambertii shows four large inversions of approximately 20,000 bp compared to Podocarpus totara. The plastid genome of P. lambertii shows a total of 28 tandem repeats and 156 simple sequence repeat (SSR). Results show that this improved protocol is suitable for enhanced quality and yield of chloroplasts and cpDNA isolation from conifers. Additionally, the sequence of the plastid genome of P. lambertii revealed significant structural differences, even in relation to other species of the same genus. The various SSRs found in the plastid genome of P. lambertii can be evaluated for intraspecific polymorphic regions, which may allow highly sensitive phylogeographic and population structure studies, as well as phylogenetic studies of species of this genus

Estrutura e evolução do genoma plastidial em Araucariaceae Henkel & W.Hochst. e Podocarpaceae Endl.

Tese (doutorado) - Universidade Federal de Santa Catarina, Centro de Ciências Agrárias, Programa de Pós-Graduação em Recursos Genéticos Vegetais, Florianópolis, 2017.As coníferas são um grupo composto por seis famílias e distribuído por todo o mundo, mas no Brasil apenas espécies das famílias Araucariaceae e Podocarpaceae apresentam ocorrência natural. A família Araucariaceae é representada pela Araucaria angustifolia e a Podocarpaceae por oito espécies do gênero Podocarpus e o Retrophyllum piresii. A Araucaria araucana e A. angustifolia são as duas únicas espécies da família Araucariaceae encontradas na América do Sul, ambas pertencentes à secção Araucaria. Esta secção é filogeneticamente irmã do grupo Bunya + Intermedia, cujas únicas representantes são a Araucaria bidwillii (nativa da Austrália) e a Araucaria hunsteinii (nativa da Nova Guiné), respectivamente. As espécies de Araucaria nativas da América do Sul sofreram uma grande exploração nas últimas décadas, resultando em uma alta fragmentação dos seus remanescentes florestais. Além disso, as famílias Podocarpaceae e Araucariaceae são consideradas umas das famílias mais antigas existentes, o que as torna interessante para estudos evolutivos. Comparações baseadas na sequência do genoma plastidial possibilitam a realização de uma série de análises estruturais e evolutivas. Além disso, há um grande potencial no estudo do genoma plastidial de coníferas para o desenvolvimento de marcadores moleculares espécie-específicos para análises de filogeografia, com implicações para o manejo e a conservação dessas espécies. Sendo assim, o presente trabalho visou realizar estudos de filogenômica, estrutura e evolução do genoma plastidial em Araucariaceae e Podocarpaceae a partir do sequenciamento completo do genoma plastidial de três espécies da família Araucariaceae (A. angustifolia, A. araucana e A. bidwillii) e uma espécie da família Podocarpaceae (R. piresii). O sequenciamento foi realizado utilizando DNA plastidial isolado para construção das bibliotecas, seguido por sequenciamento em plataforma Illumina MiSeq. A partir dos dados de sequenciamento foi realizada montagem, anotação e análise das sequências geradas, incluindo filogenia, estudos estruturais e de regiões de repetição no genoma plastidial destas coníferas. Com o sequenciamento do genoma plastidial da espécie R. piresii foi possível a identificação de sítios ativos de recombinação mediados pela presença de repetições diretas e palíndromas. Essas repetições resultam na presença de uma inversão e uma deleção no genoma plastidial. Além disso, o sequenciamento das três espécies do gênero Araucaria possibilitou a realização de análises filogenômicas dentro do gênero Araucaria de maior resolução até o momento relatadas. Os resultados obtidos possibilitarão a identificação e seleção de regiões do genoma com alta taxa evolutiva, podendo aumentar a resolução de estudos de filogeografia das espécies alvo.Abstract : Conifers are a worldwide-distributed group divided into six families. However, the families Araucariaceae and Podocarpaceae are the only indigenous to Brazil. These families are represented by one species of Araucariaceae (Araucaria angustifolia) and nine species of the Podocarpaceae, eight of the genus Podocarpus and one of Retrophyllum. Araucaria araucana and A. angustifolia are the only two species from Araucariaceae indigenous to South America, both positioned in the section Araucaria. This section is sister group to Bunya + Intermedia, whose only extant representative is Araucaria bidwillii (native to Australia) and Araucaria hunsteinii (native to New Guinea), respectively. Araucaria species native to South America have undergone extensive exploration in recent decades, resulting in a high fragmentation of forest remnants. In addition, the families Podocarpaceae and Araucariaceae are considered one of the most ancient extant families, which is interesting for evolutionary studies. Comparisons based on the plastome sequence possibilities a series of comparative, structural and phylogenetic analyzes, and may also clarify factors related to the function of repeated inverted and intergenic sequences. In addition, there is great potential of studying conifers plastomes for the development of species-specific molecular markers for phylogeography analysis, with implications in the management and conservation of these species. In this sense, the present study aimed to perform phylogenomic, structural and evolutionary analysis of the plastomes of Araucariaceae and Podocarpaceae. Thus, we sequenced the complete plastome of three species of the family Araucariaceae (A. angustifolia, A. araucana, and A. bidwillii) and one species of the family Podocarpaceae (R. piresii). The DNA sequencing was performed using isolated plastidial DNA for library construction, followed by sequencing on the Illumina MiSeq platform. From the sequencing data, assembly, annotation and analysis of the generated sequences, including phylogeny, structural studies and of regions of repetition in the plastome of these conifers were carried out. With the sequencing of the plastome of the R. piresii it was possible to identify recombination sites mediated by the presence of direct and palindromic repetitions. These repetition sites result in the presence of an inversion, and a deletion in the plastome. In addition, the sequencing of the three Araucaria species enabled to perform phylogenetic analyzes within the genus Araucaria of the highest resolution so far reported. The results obtained here will allow the identification and selection of genome regions with a high evolutionary rate, which may increase the resolution of phylogeography studies of the target species

Efeito do extrato da macroalga kappaphycus alvarezii no cultivo in vitro de epidendrum secundum Jacq

Orquídeas são plantas da família Orchidaceae, que compreende diversas espécies epífitas, rupículas e terrícolas, muitas ameaçadas de extinção. Essas espécies apresentam baixas taxas de germinação na natureza devido à ausência de reservas nutritivas na semente, sendo a propagação in vitro uma alternativa aplicável para otimizar o processo germinativo e a posterior formação de plântulas. Assim, o presente trabalho buscou otimizar as condições de cultivo in vitro de plântulas de Epidendrum secundum através da suplementação com diferentes concentrações de extrato obtido a partir da macroalga Kappaphycus alvarezii. Sementes de E. secundum foram germinadas in vitro e as plântulas obtidas foram cultivadas em meio de cultura MS, com a concentração de sais reduzido pela metade (MS/2), suplementado com 3% de sacarose e diferentes concentrações do extrato: 0, 6, 12, 25, 50, 100 mg L-1. Como resultados do cultivo in vitro, observou-se que a presença do extrato de K. alvarezii estimulou de forma crescente o desenvolvimento das plântulas, proporcionalmente ao aumento da concentração, exceto na maior concentração testada (100 mg L-1), onde demonstrou um efeito deletério. Das concentrações testadas, o tratamento com 50 mg L-1 apresentou os melhores resultados, favorecendo significativamente o aumento das plântulas, número e comprimento das folhas e raízes, ganho de massa fresca e número de brotos formados.. Com isso, o uso do extrato de K. alvarezii indica potencial de aplicação como um composto natural bioativo no cultivo in vitro de E. secundum devido ao seu notório efeito bioestimulante na morfogênese in vitro desta espécieFil: Amatuzi, Julio César de Araujo. Universidad Federal de Paraná (Brasil)Fil: Hayashi, Leila. Universidad Federal de Paraná (Brasil)Fil: Vieira, Leila do Nascimento. Universidad Federal de Paraná (Brasil)Fil: Fraga, Hugo Pacheco de Freitas. Universidad Federal de Paraná (Brasil

Cloning and expression of embryogenesis-regulating genes in Araucaria angustifolia (Bert.) O. Kuntze (Brazilian Pine)

Angiosperm and gymnosperm plants evolved from a common ancestor about 300 million years ago. Apart from morphological and structural differences in embryogenesis and seed origin, a set of embryogenesis-regulating genes and the molecular mechanisms involved in embryo development seem to have been conserved alike in both taxa. Few studies have covered molecular aspects of embryogenesis in the Brazilian pine, the only economically important native conifer in Brazil. Thus eight embryogenesis-regulating genes, viz., ARGONAUTE 1, CUP-SHAPED COTYLEDON 1, WUSCHEL-related WOX, S-LOCUS LECTIN PROTEIN KINASE, SCARECROW-like, VICILIN 7S, LEAFY COTYLEDON 1, and REVERSIBLE GLYCOSYLATED POLYPEPTIDE 1, were analyzed through semi-quantitative RT-PCR during embryo development and germination. All the eight were found to be differentially expressed in the various developmental stages of zygotic embryos, seeds and seedling tissues. To our knowledge, this is the first report on embryogenesis-regulating gene expression in members of the Araucariaceae family, as well as in plants with recalcitrant seeds

Mortality from gastrointestinal congenital anomalies at 264 hospitals in 74 low-income, middle-income, and high-income countries: a multicentre, international, prospective cohort study

Summary Background Congenital anomalies are the fifth leading cause of mortality in children younger than 5 years globally. Many gastrointestinal congenital anomalies are fatal without timely access to neonatal surgical care, but few studies have been done on these conditions in low-income and middle-income countries (LMICs). We compared outcomes of the seven most common gastrointestinal congenital anomalies in low-income, middle-income, and high-income countries globally, and identified factors associated with mortality. Methods We did a multicentre, international prospective cohort study of patients younger than 16 years, presenting to hospital for the first time with oesophageal atresia, congenital diaphragmatic hernia, intestinal atresia, gastroschisis, exomphalos, anorectal malformation, and Hirschsprung’s disease. Recruitment was of consecutive patients for a minimum of 1 month between October, 2018, and April, 2019. We collected data on patient demographics, clinical status, interventions, and outcomes using the REDCap platform. Patients were followed up for 30 days after primary intervention, or 30 days after admission if they did not receive an intervention. The primary outcome was all-cause, in-hospital mortality for all conditions combined and each condition individually, stratified by country income status. We did a complete case analysis. Findings We included 3849 patients with 3975 study conditions (560 with oesophageal atresia, 448 with congenital diaphragmatic hernia, 681 with intestinal atresia, 453 with gastroschisis, 325 with exomphalos, 991 with anorectal malformation, and 517 with Hirschsprung’s disease) from 264 hospitals (89 in high-income countries, 166 in middleincome countries, and nine in low-income countries) in 74 countries. Of the 3849 patients, 2231 (58·0%) were male. Median gestational age at birth was 38 weeks (IQR 36–39) and median bodyweight at presentation was 2·8 kg (2·3–3·3). Mortality among all patients was 37 (39·8%) of 93 in low-income countries, 583 (20·4%) of 2860 in middle-income countries, and 50 (5·6%) of 896 in high-income countries (p<0·0001 between all country income groups). Gastroschisis had the greatest difference in mortality between country income strata (nine [90·0%] of ten in lowincome countries, 97 [31·9%] of 304 in middle-income countries, and two [1·4%] of 139 in high-income countries; p≤0·0001 between all country income groups). Factors significantly associated with higher mortality for all patients combined included country income status (low-income vs high-income countries, risk ratio 2·78 [95% CI 1·88–4·11], p<0·0001; middle-income vs high-income countries, 2·11 [1·59–2·79], p<0·0001), sepsis at presentation (1·20 [1·04–1·40], p=0·016), higher American Society of Anesthesiologists (ASA) score at primary intervention (ASA 4–5 vs ASA 1–2, 1·82 [1·40–2·35], p<0·0001; ASA 3 vs ASA 1–2, 1·58, [1·30–1·92], p<0·0001]), surgical safety checklist not used (1·39 [1·02–1·90], p=0·035), and ventilation or parenteral nutrition unavailable when needed (ventilation 1·96, [1·41–2·71], p=0·0001; parenteral nutrition 1·35, [1·05–1·74], p=0·018). Administration of parenteral nutrition (0·61, [0·47–0·79], p=0·0002) and use of a peripherally inserted central catheter (0·65 [0·50–0·86], p=0·0024) or percutaneous central line (0·69 [0·48–1·00], p=0·049) were associated with lower mortality. Interpretation Unacceptable differences in mortality exist for gastrointestinal congenital anomalies between lowincome, middle-income, and high-income countries. Improving access to quality neonatal surgical care in LMICs will be vital to achieve Sustainable Development Goal 3.2 of ending preventable deaths in neonates and children younger than 5 years by 2030

Plastid genomics in horticultural species: importance and applications for plant population genetics, evolution, and biotechnology

During the evolution of the eukaryotic cell, plastids, and mitochondria arose from an endosymbiotic process, which determined the presence of three genetic compartments into the incipient plant cell. After that, these three genetic materials from host and symbiont suffered several rearrangements, bringing on a complex interaction between nuclear and organellar gene products. Nowadays, plastids harbor a small genome with ∼130 genes in a 100–220 kb sequence in higher plants. Plastid genes are mostly highly conserved between plant species, being useful for phylogenetic analysis in higher taxa. However, intergenic spacers have a relatively higher mutation rate and are important markers to phylogeographical and plant population genetics analyses. The predominant uniparental inheritance of plastids is like a highly desirable feature for phylogeny studies. Moreover, the gene content and genome rearrangements are efficient tools to capture and understand evolutionary events between different plant species. Currently, genetic engineering of the plastid genome (plastome) offers a number of attractive advantages as high-level of foreign protein expression, marker gene excision, gene expression in operon and transgene containment because of maternal inheritance of plastid genome in most crops. Therefore, plastid genome can be used for adding new characteristics related to synthesis of metabolic compounds, biopharmaceutical, and tolerance to biotic and abiotic stresses. Here, we describe the importance and applications of plastid genome as tools for genetic and evolutionary studies, and plastid transformation focusing on increasing the performance of horticultural species in the field

Gene expression during early somatic embryogenesis in Brazilian pine (Araucaria angustifolia (Bert) O. Ktze)

Brazilian pine (Araucaria angustifolia (Bert) O. Ktze) is the only native conifer species with economic importance in Brazil. Recently, due to intensive exploitation Brazilian pine was included in the official list of endangered Brazilian plants, under the "vulnerable" category. Biotechnology tools like somatic embryogenesis (SE) are potentially useful for mass clonal propagation and ex situ conservation strategies of commercial and endangered plant species. In spite of that, numerous obstacles still hamper the full application of SE technology for a wider range of species, including Brazilian pine. To enhance somatic embryogenesis in Brazilian pine and to gain a better understanding of the molecular events associated with somatic embryo development, we analyzed the steady-state transcript levels of genes known to regulate somatic embryogenesis using semiquantitative reverse transcription polymerase chain reaction (sqRT-PCR). These genes included Argonaute (AaAGO), Cup-shaped cotyledon1 (AaCUC), wushel-related WOX (AaWOX), a S-locus lectin protein kinase (AaLecK), Scarecrow- like (AaSCR), Vicilin 7S (AaVIC), Leafy Cotyledon 1 (AaLEC), and a Reversible glycosylated polypeptide (AaRGP). Expression patterns of these selected genes were investigated in embryogenic cultures undergoing different stages of embryogenesis, and all the way to maturation. Up-regulation of AaAGO, AaCUC, AaWOX, AaLecK, and AaVIC was observed during transition of somatic embryos from stage I to stage II. During the maintenance phase of somatic embryogenesis, expression of AaAGO and AaSCR, but not AaRPG and AaLEC genes was influenced by presence/ absence of plant growth regulators, both auxins and cytokinins. The results presented here provide new insights on the molecular mechanisms responsible for somatic embryo formation, and how selected genes may be used as molecular markers for Brazilian pine embryogenesis.National Counsel of Technological and Scientific Development (CNPq)National Counsel of Technological and Scientific Development (CNPq)CAPESCAPESSanta Catarina State Research Agency (FAPESC)Santa Catarina State Research Agency (FAPESC) [152306/2007-2]ALWSALWS [02437/09-0