Caracterización bioquímica, biológica y molecular de la L-aminoácido oxidasa del veneno de la serpiente peruana Bothrops pictus "Jergón de Costa"

Se ha purificado y caracterizado la L-Aminoácido oxidasa del veneno de la serpiente Bothrops pictus “Jergón de costa” (BpicLAAO), mediante cromatografía de filtración molecular sobre Sephadex G-100, seguida de una cromatografía de intercambio catiónico sobre CM Sephadex C-50, ambas equilibradas con buffer acetato de amonio 0,05M pH 6. El grado de purificación fue de 22,02 veces con una actividad específica de 4,25 U/mg. La pureza de la proteína fue evaluada por HPLC en fase reversa y mediante PAGE-SDS. Es una proteína ácida conteniendo 18,7 % de carbohidratos asociados, con un peso molecular de 132,27 kDa, por cromatografía de filtración y de 65,2 y 58,6 kDa por PAGESDS bajo condiciones reductoras y no reductoras respectivamente, evidenciando que se trata de una enzima homodimérica con al menos un puente disulfuro intracatenario, el cual es importante para su actividad. El peso de la enzima disminuyó a 47 kDa después del tratamiento con PNGasa F. La enzima mostró un pH óptimo de 8,5 usando L-leucina como substrato, es inestable en el rango de pH alcalino a partir de 9,0; tolera hasta los 55 ºC. La actividad enzimática disminuyó considerablemente en presencia de Zn2+, glutatión y 2-mercaptoetanol, lo que sugiere la presencia de por lo menos un puente disulfuro intracatenario para su actividad. BpicLAAO presenta actividad hemorrágica sobre piel de ratones albinos siendo la dosis hemorrágica mínima de 2,79 μg de proteína, produce edema, habiéndose calculado la dosis edemática mínima en 7,80 μg de proteína; también inhibe la agregación plaquetaria inducida por ADP de una manera dosis dependiente. El efecto antibacteriano tanto del veneno crudo como de la enzima purificada se evidenció sobre cultivos de bacterias Gram positivas y Gram negativas, observándose que las Gram positivas son más susceptibles que las Gram negativas. Se demostró la antigenicidad de la enzima por inmunodifusión e inmunoelectroforesis, usando suero antibotrópico polivalente. Asímismo mediante el análisis molecular a partir de las secuencias de cDNA de LAAO de B. pictus se obtuvo una secuencia de 1494 pb que codifica un péptido señal y una proteína madura de 487 residuos aminoacìdicos. BpicLAAO, muestra homología con otras enzimas similares de venenos de serpientes habiéndose identificado los aminoácidos correspondientes a los dominios de unión al FAD, de unión al substrato y el dominio helicoidal. Encontrándose además dos motivos para N-glicosilación. Palabras clave: enzima, flavoproteína, N-glicosilación, secuencia nucleotídica, serpiente, veneno.Tesi

Purificación, caracterización y actividad biológica de una L-aminoácido oxidasa presente en el veneno de la serpiente Bothrops atrox "Jergón"

Se ha purificado y caracterizado la L-Aminoácido oxidasa del veneno de la serpiente Bothrops atrox, empleando dos pasos cromatográficos, una columna de filtración molecular sobre Sephadex G-100 y otra de intercambio catiónico sobre CM-Sephadex C-50 equilibrada con buffer acetato de amonio 0,05M pH 6. El grado de purificación fue de 12,14 veces con una actividad específica de 4,13 U/mg. Esta enzima es una glicoproteína ácida (17 % de carbohidratos asociados), homodimérica de 127,879 daltons de peso molecular, formada por dos subunidades de 63,128 daltons y posee por lo menos un enlace disulfuro intracatenario, que es importante para su actividad. La enzima mostró un pH óptimo de 8,3 usando L-leucina como substrato, es inestable en el rango de pH alcalino a partir de 9,0; pierde actividad en presencia de Zn2+ y tolera tamperaturas hasta los 55ºC. Se demostró la pureza y antigenicidad de la enzima mediante inmunodifusión e inmunoelectroforesis, empleando suero antibotrópico polivalente. Así mismo el efecto antibacteriano tanto del veneno crudo como de la enzima purificada se evidenció utilizando la técnica de Grove sobre cultivos de Staphylococcus aureus, Streptococcus faecalis, Vibrio cholerae y Escherichia coli observándose que las bacterias Gram positivas son más susceptibles que las Gram negativas. Además el veneno crudo de B. atrox y LAO presentaron un efecto in vitro contra promastigotes de Leishmania braziliensis braziliensis con una CE50 de 7,82 y 1,33 μg/ml respectivamente y contra epimastigotes de Trypanosoma cruzi, con una CE50 de 7,95 μg/ml para el veneno crudo y 1,38 μg/ml para la enzima purificada. La enzima L-aminoácido oxidasa no tiene actividad hemorrágica sobre piel de ratones albinos, ni hemolítica sobre eritrocitos humanos lavados. Sin embargo produce edema, habiéndose calculado la DEM en 15,18 μg de proteína. Palabras clave: L-aminoácido oxidasa, serpiente, enzima, Bothrops atrox, veneno.A L-Aminoacid oxidase enzyme was purified and characterized from Bothrops atrox snake venom by two steps. It used a Sephadex G-100 column and ion exchange on CM-Sephadex C-50 at pH 6. The purification grade was 12,14 folds with a specific activity of 4,13 U/mg. This enzyme with a molecular weight of 127,879 daltons as determined by gel filtration is a noncovalent dimmer consisting of two subunits with a molecular weight each of 63,128 daltons as determined by SDS-PAGE, with at least one intrachain disulfide bond that is important for its activity. The enzyme exhibited a optimun pH of 8,3 using L- leucine as substrate. It is an acid glicoprotein containing 17% carbohydrate, being thermoestable till 55 ºC, labil to alkaline pH and susceptible to presence of Zn 2+. The antigenicity and homogeneity of enzyme was demonstrated by inmunodiffusion and inmunoelectrophoresis using polivalent antibothropic antivenom. Beside antibacterial effect of whole venom as well as purified enzyme was demonstrated by Grove’s method on Staphylococcus aureus, Streptococcus faecalis, Vibrio cholerae and Escherichia coli grown cultures, being Gram positive bacterials, more susceptible than Gram-negative bacterials. Moreover B. atrox crude venom and its purified enzyme LAO, presented an in vitro effect against Leishmania braziliensis braziliensis promastigotes with an EC50 of 7,82 and 1,33 μg/ml respectively, and Trypanosoma cruzi epimastigotes with an EC50 of 7,95 ug/ml for whole venom and 1,38 μg/ml for purified enzyme. LAO does not have haemorragic nor hemolytic activities on mouse skin (20-22 g body weight) and human red blood cells respectively. However LAO produces edema with a DEM of 15,18 μg of protein. Key words: L-amino acid oxidase, snake, enzyme, Bothrops atrox, venomTesi

Comparative Study of Algorithms Metaheuristics Based Applied to the Solution of the Capacitated Vehicle Routing Problem

This chapter presents the best-known heuristics and metaheuristics that are applied to solve the capacitated vehicle routing problem (CVRP), which is the generalization of the TSP, in which the nodes are visited by more than one route. To find out which algorithm obtains better results, there are 30 test instances used, which are grouped into 3 sets of problems according to the position of the nodes. The study begins with an economic impact analysis of the transportation sector in companies, which represents up to 20% of the final cost of the product. This case study focuses on the CVRP for its acronym capacitated vehicle routing problem, analyzing the best-known heuristics such as Clarke & Wright and sweep, and the algorithms GRASP and simulated annealing metaheuristics based

Partial characterization of the venom of the Peruvian rattlesnake Crotalus durissus terrificus

Se ha investigado el contenido proteico y algunas actividades enzimáticas del veneno de la serpiente cascabel Crotalus durissus terrificus procedente de la región de Sandia, Puno; para ello se empleó el veneno total así como las fracciones obtenidas mediante cromatografía de filtración en Sephadex G-100. El porcentaje de proteína calculado por el método de Lowry fue de 68,6% para el veneno total; habiéndose obtenido 3 picos de proteína durante el fraccionamiento; en el primero se registró actividad proteolítica, en el segundo, las actividades amidolítica, coagulante y fosfolipasa A2, mientras que en el tercero se detectó otra fracción proteolítica. No se registró la actividad acetilcolinesterasa mientras que la actividad L-aminoácido oxidasa sólo se encontró en el veneno total.The venom of the rattlesnake Crotalus durissus terrificus from the region of Sandia, Puno, has been investigated for its protein content and some enzymatic activities, using for it the whole venom as well as the fractions obtained by gel filtration chromatography in Sephadex G-100. The protein percentage calculated by the method of Lowry was of 68,6% for the whole venom; 3 peaks were obtained during the fractionation; the first showed proteolytic activity, the second, amidolytic, clotting and phospholipase A2 activities, while the third, another proteolytic activity. Acetylcholinesterase activity was not found while L-aminoacid oxidase activity was found only in the whole venom

Molecular identification and activity upon chromogenic substrates of a venombin A from Bothrops atrox Peruvian snake venom

En el presente trabajo se ha realizado la identificación molecular de la enzima similar a trombina (EST) del veneno de Bothrops atrox y se ha evaluado su actividad enzimática sobre diversos sustratos sintéticos. La enzima fue purificada utilizando tres pasos cromatrográficos, sobre Sephadex G-75, CM-Sephadex C-50 y Agarosa-PAB, determinándose su peso molecular por PAGE-SDS. La identificación molecular de la enzima aislada se realizó por la técnica de peptide mass fingerprinting basada en espectrometría de masas MALDI-TOF y posterior análisis in silico. Las actividades fibrinocoagulante y amidolítica fueron ensayadas sobre fibrinó- geno bovino y BApNA, respectivamente, así como la hidrólisis sobre los sustratos cromogénicos específicos S-2238, S-2251 y S-2266. Como resultado de los ensayos bioquímicos y estructurales, la EST del veneno de B. atrox, presentó un peso molecular de 29,6 kDa. El análisis mediante espectrometría de masas de los péptidos obtenidos, permitió identificar a esta enzima como una venombina A, presentando una identidad del 75%. Del análisis de actividad enzimática, se obtuvo que la EST de B. atrox produjo coagulación del fibrinógeno bovino y presentó actividad sobre BApNA, S-2238 y S-2266, siendo incapaz de hidrolizar el sustrato S-2251. El empleo de estas aproximaciones estructurales y funcionales ha permitido lograr la identificación molecular del principal componente del veneno de B. atrox relacionado con su acción coagulante, así como evaluar en detalle la naturaleza de su actividad enzimática sobre diversos sustratos.n this work, the thrombin-like enzyme (TLE) from Bothrops atrox has been identified by mass spectrometry and its enzymatic activity evaluated upon several synthetic substrates. The enzyme was purified to homogeneity using three chromatography steps on Sephadex G-75, CM-Sephadex C-50 and Agarose-PAB. Also, molecular weight by PAGE-SDS was determined. For molecular identification of this enzyme, mass spectrometry-based peptide mass fingerprinting was used and later in silico analysis. Enzymatic activities were determined using bovine fibrinogen, BApNA and also upon specific chromogenic substrates such as S-2238, S-2251 y S-2266. As a result of these biochemical and structural procedures, we obtained a TLE from B. atrox venom with a molecular weight of 29,6 kDa. Mass spectrometry analysis of obtained peptides, allow us to identify this enzyme as a venombin A, showing a 75% sequence homology. After recording enzymatic activity, this TLE showed coagulant activity on bovine fibrinogen and upon BApNA, S-2238 y S-2266, being unable to hydrolyze S-2251 substrate. Using this combination of structural and functional approaches, we have identified the main component of B. atrox venom related to its coagulant activity, as well as a detailed evaluation of its enzymatic activity upon several substrate

Biological characterization and inhibitors action of Phospholipase A2 from Lachesis muta venom

El presente trabajo informa de la purificación y caracterización bioquímica y biológica de la fosfolipasa A2 (PLA2) de Lachesis muta (Linnaeus, 1766). La purificación se realizó por cromatografía liquida (CL) usando CM-Sephadex C-50 y Sephadex G-50, obteniéndola al estado homogéneo con un peso molecular de 18749 Da. Los ensayos con PLA2 realizados sobre fosfolípidos de yema de huevo y lecitina comercial, mostraron que los agentes EDTA, PMSF, glutatión y cisteína, inhibieron la actividad con valores mayores al 50%. La PLA2 de L. muta produjo un notable efecto anticoagulante, observándose un retardo de 2'30" en el tiempo de coagulación con 9,6 µg de la enzima. La hemólisis indirecta sobre eritrocitos humanos dio un equivalente de 4,35 µg como dosis hemolítica media (HD50). Los valores de dosis edemática media y dosis miotóxica mínima fueron de 91,5 µg y 125,89 µg/mL respectivamente; valores por debajo de PLA2 de otros venenos. No se registró actividad hemorrágica directa. Las pruebas de inmunodifusión e inmunoelectroforésis revelaron que PLA2 de L. muta tuvo reactividad inmunogénica contra el antiveneno lachésico monovalente (INS-Perú). Sin embargo, la neutralización por el antiveneno fue parcial.In the present study, phospholipase A2 (PLA2) from Lachesis muta (Linnaeus, 1766), is isolated, purified and characterized biochemically and biologically. Purification was performed by liquid chromatography (LC) using CM-Sephadex C-50 and Sephadex G-50, homogenized enzyme had a molecular weight of 18749 Da. Trials with egg yolk phospholipids, and commercial lecithin showed that EDTA, PMSF, glutathione and cysteine inhibited the activity with values greater than 50%. The PLA2 had a significant anticoagulant effect, showing a delay of 2'30" on the coagulation time with 9.6 µg of the enzyme. The indirect impact on human erythrocyte hemolysis gave an equivalent of 4.35 µg as HD50. Mean edematic dose and minimum myotoxic dose were 91.5 mg and 125.89 mg / mL respectively, these values were below enzymes phospholipase A2 from others poisons. There was no hemorrhagic activity. Immunodiffusion tests and immunoelectrophoresis revealed that the PLA2 of L. muta was immunogenic reactivity against lachesic monovalent antivenom (INS-Peru). However, the neutralization by the antivenom was partial

PURIFICACIÓN Y CARACTERIZACIÓN BIOQUÍMICA DE LA ENZIMA SIMILAR A TROMBINA DEL VENENO DE LA SERPIENTE Bothrops brazili

A coagulant enzyme from Bothrops brazili snake venom called thrombin-like enzyme was purified by three successive chromatographic steps on Sephadex G-75, DEAE Sephadex A-50 and Sephadex G-50 using 0.05M Tris-HCl buffer pH 8.5. The enzyme was purified 15.9 times with a yield of 28.6% and by PAGE-SDS a single protein band of 48 kDa was obtained both in reducing and non-reducing conditions using 2β-Mercaptoethano., It is a unicatenaryprotein with coagulant activity on both citrated human plasma and bovine fibrinogen. The enzyme showed amidolytic activity on the chromogenic substrate Benzoyl-Arginyl-pNitroaniline (BApNA) and the coagulant potency on bovine fibrinogen was calculated on 121 NIH units of thrombin / mg. The enzyme was inhibited by PMSF and the soybean trypsin inhibitor, therefore, it is a serine protease; the optimum pH for the amidolytic activity was 8.5 and the protein was stable to heat treatment only up to 40 °C. The minimal defibrinogenating dose was 8 μg / g of mouse and by double immunodiffusion tests immunoreactivity was observed with respect to INS polyvalent antibothropic serum.Se ha purificado una enzima coagulante del veneno de la serpiente Bothrops brazili denominada enzima similar a trombina (TLE) mediante tres pasos cromatográficos sucesivos sobre Sephadex G-75, DEAE Sephadex A-50 y Sephadex G-50, empleando buffer Tris-HCl 0,05 M pH 8,5. La enzima fue purificada 15,9 veces con un rendimiento del 28,6 % y por PAGE-SDS se obtuvo una sola banda proteica de 48 kDa, tanto en condiciones reductoras como no reductoras usando 2β-Mercaptoetanol. Se trata de una proteína con actividad coagulante, tanto sobre plasma humano citratado como sobre fibrinógeno bovino. La enzima mostró actividad amidolítica sobre el sustrato cromogénico Benzoil-Arginil-p-Nitroanilina (BApNA) y la potencia coagulante sobre el fibrinógeno bovino fue calculada en 121 unidades NIH de trombina/mg. La enzima fue inhibida por PMSF y por el inhibidor de tripsina de soya, por lo que se trata de una serinoproteasa; el pH óptimo para la actividad amidolítica fue de 8,5 y la proteína fue estable al tratamiento térmico solo hasta los 40 ºC. La dosis defibrinogenante mínima fue 8 μg/g de ratón y mediante pruebas de inmunodifusión doble se observó inmunorreactividad con respecto al suero antibotrópico polivalente del INS

Dimensión vertical y estudio imagenológico de la articulación temporomandibular

En la práctica odontológica cotidiana, nos enfrentamos a una gran variedad de casos donde los patrones estandarizados y agrupados dentro de la "oclusión normal" se encuentran alterados: pérdida de piezas dentarias, extrusión, atrición dentaria, etc., que requieren rehabilitación protésíca, donde uno de los factores críticos es la dimensión vertical, pues esta determina los aspectos físicos y funcionales del paciente, además del restablecimiento del sistema estomatognático. Alteraciones de la dimensión vertical puede repercutir en el estado neuromuscular, propíoceptivo y postura! del paciente y puede causar trastornos temporomandibulares.Facultad de Odontologí

Erupción ectópica

Este trabajo se realizó sobre 300 pacientes y radiografías panorámicas en una población de la ciudad de La Plata cuyo rango de edad abarca entre 4 y 14 años. La erupción ectópica es un trastorno en el que el diente no sigue su curso normal. Si el diente erupciona de forma ectópica en el lugar de un diente contiguo, se denomina como transposición dental y la transmigración dental es cuando ocurre la migración fisiológica de un diente a través de la línea media hacia el lado opuesto que le corresponde.Facultad de Odontologí

Erupción ectópica

Este trabajo se realizó sobre 300 pacientes y radiografías panorámicas en una población de la ciudad de La Plata cuyo rango de edad abarca entre 4 y 14 años. La erupción ectópica es un trastorno en el que el diente no sigue su curso normal. Si el diente erupciona de forma ectópica en el lugar de un diente contiguo, se denomina como transposición dental y la transmigración dental es cuando ocurre la migración fisiológica de un diente a través de la línea media hacia el lado opuesto que le corresponde.Facultad de Odontologí