Identificación de genes y polimorfismos asociados a fenotipos óseos

El deterioro óseo sucede principalmente como consecuencia del envejecimiento en ambos sexos y particularmente con la depleción estrogénica que ocurre durante la menopausia en la mujer. Este deterioro en la calidad ósea puede desembocar finalmente en el desarrollo de patologías óseas como la osteoporosis, y en última instancia en el fenotipo clínico de peor pronóstico, la fractura ósea por fragilidad. Ambos fenotipos, la osteoporosis y la fractura por fragilidad, se consideran patologías complejas o multifactoriales; esto es, influenciadas por múltiples factores entre los que se encuentran factores genéticos, epigenéticos o ambientales. En la caracterización de los factores genéticos que intervienen en estos fenotipos se han venido utilizando múltiples aproximaciones, cada vez más costosas, pero que, en conjunto, no han llegado a explicar más que un pequeño porcentaje de la varianza fenotípica total observada. En los últimos años se ha demostrado que la interacción de los sistemas óseo, inmune y hematopoyético trasciende de la de meros compañeros de nicho, pues sus células principales ocupan el mismo espacio-tiempo en la médula ósea, lo que hace posible múltiples interacciones entre ellas. Ésto ha hecho necesaria la creación de una nueva disciplina de estudio, que se ha bautizado como Osteoinmunología. El objetivo principal de este trabajo de Tesis Doctoral ha sido la caracterización genética de los fenotipos mencionados y para ello se han realizado distintos abordajes, algunos de ellos muy novedosos. El abordaje más clásico es el de los estudios de asociación bajo hipótesis previa, también conocidos como estudios de genes candidatos. En el presente trabajo se ha usado esta aproximación y así, se ha intentado la replicación de estudios previos de otros investigadores, pero también se han elegido para su estudio genes candidatos relacionados con la osteoinmunología como CD40 y CD40L. Sin embargo, el presente trabajo no se ha limitado a identificar una posible asociación genética, sino que, además, se ha centrado en intentar determinar la funcionalidad de los polimorfismos, integrando los resultados desde una aproximación global, en la que se pretende abordar el problema desde una perspectiva traslacional e integradora. Fruto de estos abordajes se ha conseguido corroborar o describir por primera vez la asociación a fenotipos óseos de polimorfismos en los genes CD40, CD40L, y LRP5, entre otros. Un abordaje novedoso del presente trabajo ha sido el uso de aproximaciones traslacionales desde modelos animales y celulares para la identificación de nuevos genes candidatos para su estudio en nuestra cohorte de mujeres. Así, la aproximación traslacional desde el modelo animal de pérdida ósea acelerada, como es el ratón sometido a ovariectomía, ha aportado nuevos genes candidatos y ha subrayado el papel crucial de la célula B en la regulación de la homeostasis ósea debida al déficit de estrógenos, lo que nos ha servido de modelo de lo que sucede en la menopausia. Por este motivo se ha realizado por primera vez un estudio en el que se ha analizado la expresión génica diferencial mediante microarrays entre células B de médula ósea de ratonas ovariectomizadas y SHAM. De esta manera se han asociado por primera vez a fenotipos óseos polimorfismos en los genes CD80, CD86 y MMP9. Estos resultados apuntan a que el papel de la célula B en la regulación de la homeostasis ósea no está ni mucho menos esclarecido. Por último, en el presente trabajo se ha tratado de caracterizar la fractura por fragilidad desde un punto de vista más clínico, mediante la determinación de parámetros clásicos, pero también de novedosas determinaciones de miRNAs séricos, lo que nos ha llevado a describir diversos parámetros que pueden postularse como potenciales biomarcadores del riesgo de fractura como el nivel de fosfato o de HDL o tres miRNAs séricos, en especial miR-21-5p

Desarrollo de un modelo animal de cirrosis hepática por alcohol: Estudio de la contribución de la inflamación y la hiperamonemia a las alteraciones cognitivas y motoras en encefalopatía hepática

La encefalopatía hepática es un síndrome neuropsiquiátrico complejo que se puede presentar en pacientes con enfermedades hepáticas crónicas o agudas. La disfunción hepática conduce a alteraciones en la función cerebral y a una serie de alteraciones neurológicas. Estas alteraciones incluyen, entre otras, un deterioro de la función intelectual, con disminución de la capacidad de atención, alteraciones visuo-espaciales y en la escritura y disminución de la capacidad de aprendizaje y memoria. Se considera que la hiperamonemia es la principal responsable de las alteraciones neurológicas en encefalopatía hepática. A pesar de que el consumo de alcohol es responsable de un elevado porcentaje de los casos de cirrosis hepática, no disponemos de ningún modelo animal adecuado de cirrosis por alcohol. El objetivo principal de este estudio es desarrollar y caracterizar un modelo animal de cirrosis y encefalopatía hepática por alcohol y analizar sus alteraciones cognitivas y motoras, así como clarificar el papel de la hiperamonemia y la inflamación en el deterioro cognitivo y motor. Para ello hemos desarrollado un modelo animal de cirrosis "mixto" en el cual hemos utilizado el tratamiento con etanol y las ratas se sometieron a ligadura biliar (BDL). Estudios previos con este modelo indicaban que las concentraciones del 5 y 8% de etanol producían un estadio de fibrosis hepática. En este estudio hemos aumentado la concentración de etanol al 10% para evaluar si es suficiente para llegar a cirrosis hepática. Se determinaron parámetros bioquímicos en sangre, se ensayaron actividades motoras, de aprendizaje y memoria y se realizó análisis histológico del hígado para la cuantificación del grado de fibrosis/cirrosis hepática. A las dos semanas después de la cirugía y el tratamiento con etanol, las ratas BDL y BDL-etanol ya presentaban niveles de amonio en sangre significativamente aumentados, así como los marcadores hepáticos (GOT, GPT, bilirrubina y fosfatasas alcalinas) con respecto a las ratas control. Además observamos una disminución en los niveles de interleucinas anti-inflamatorias (IL-4 e IL-10), y un aumento de la interleucina pro-inflamatoria IL-6 en las ratas tratadas (BDL y BDL-etanol) con respecto a los controles, así como un aumento en la metaloproteinasa MMP-9, indicador de fibrosis que aumenta con la inflamación. La actividad motora de las ratas BDL, medida en un actímetro, estaba significativamente disminuida con respecto a las ratas control. En las ratas BDL-etanol la actividad motora tiende a estar también disminuida. Utilizando la prueba del laberinto en Y para evaluar la capacidad de memoria, tanto BDL como BDL-alcohol necesitaron más intentos en esta prueba, indicando una disminución en la capacidad de memoria. El estudio morfométrico del hígado reveló un aumento de fibrosis en los modelos BDL y BDL-etanol llegando a cirrosis en algunos casos. El modelo animal desarrollado es un buen modelo de fibrosis, cirrosis y encefalopatía hepáticas inducidas por alcohol que reproduce alteraciones de hiperamonemia, inflamación y alteraciones neurológicas observadas en pacientes con enfermedad hepática.Panach González, L. (2011). Desarrollo de un modelo animal de cirrosis hepática por alcohol: Estudio de la contribución de la inflamación y la hiperamonemia a las alteraciones cognitivas y motoras en encefalopatía hepática. http://hdl.handle.net/10251/15382Archivo delegad

Polymorphisms in Genes Involved in Osteoblast Differentiation and Function Are Associated with Anthropometric Phenotypes in Spanish Women

Much of the genetic variance associated with osteoporosis is still unknown. Bone mineral density (BMD) is the main predictor of osteoporosis risk, although other anthropometric phenotypes have recently gained importance. The aim of this study was to analyze the association of SNPs in genes involved in osteoblast differentiation and function with BMD, body mass index (BMI), and waist (WC) and hip (HC) circumferences. Four genes that affect osteoblast differentiation and/or function were selected from among the differentially expressed genes in fragility hip fracture (FOXC1, CTNNB1, MEF2C, and EBF2), and an association study of four single-nucleotide polymorphisms (SNPs) was conducted in a cohort of 1001 women. Possible allelic imbalance was also studied for SNP rs87939 of the CTNNB1 gene. We found significant associations of SNP rs87939 of the CTNNB1 gene with LS-sBMD, and of SNP rs1366594 of the MEF2C gene with BMI, after adjustment for confounding variables. The SNP of the MEF2C gene also showed a significant trend to association with FN-sBMD (p = 0.009). A possible allelic imbalance was ruled out as no differences for each allele were detected in CTNNB1 expression in primary osteoblasts obtained from homozygous women. In conclusion, we demonstrated that two SNPs in the MEF2C and CTNNB1 genes, both implicated in osteoblast differentiation and/or function, are associated with BMI and LS-sBMD, respectively