RhoA Regulates Peroxisome Association to Microtubules and the Actin Cytoskeleton

Peer reviewe

Charakterisierung der peroxisomalen ARF-Bindung

Zu Beginn der vorliegenden Arbeit war bekannt, daß ARF (ADP-Ribosylierungsfaktor) zusammen mit Coatomer an isolierte Peroxisomen der Rattenleber bindet. Darauf aufbauend wurde zunächst gezeigt, daß die ARF-Bindung für Peroxisomen spezifisch ist und von einer Behandlung der Tiere mit Peroxisomenproliferatoren abhängt. Von den sechs bei Säugern bekannten ARF-Isoformen konnten ARF1 und ARF6 an der Peroxisomenmembran identifiziert werden. Funktionelle Studien zeigten, daß ARF1 nicht jedoch ARF6 für die Rekrutierung von Coatomer an Peroxisomen essentiell ist. Dabei modulieren ATP und Faktoren aus dem Cytosol in synergistischer Weise insbesondere die ARF1-Rekrutierung. Zudem lieferten Experimente in flottierenden Nycodenzgradienten in vitro Hinweise zur ARF- und Coatomer-abhängigen Generierung einer zusätzlichen peroxisomalen Population. Die in vivo-Relevanz wurde am Modell der Hefe S. cerevisiae mit ARF- und Coatomer-mutanten untersucht. Die oleatinduzierte Proliferation der Peroxisomen konnte dabei durch inaktiven Coatomer oder funktionsloses ARF1 inhibiert werden. Demgegenüber führte die Deletion von ScARF3, dem Hefe-Homologen des Säuger-ARF6, zu einer verstärkten Proliferation unter Oleat. Neben der ARF1/Coatomer-abhängigen Bildung peroxisomaler Vesikel scheint ein zweiter Mechanismus der Peroxisomenvermehrung zu existieren. An ihm könnten neben Pex11?p auch Komponenten des Aktincytoskeletts beteiligt sein. So konnte in der vorliegenden Arbeit das Aktin-bindende Myosin MYH9 an einer durch ATP generierten peroxisomalen Subpopulation identifiziert werden. Des weiteren zeigen Arbeiten anderer Gruppen eine Beteiligung des Dynamin-ähnlichen Proteins DLP-1 an einem späteren Stadium der peroxisomalen Teilung. So führt die Deletion von DLP-1 in Zusammenhang mit Pex11?p-Expression zur Ausbildung tubulärer Peroxisomen. Eigene Befunde zeigen nach Expression von Pex11?p-Varianten ebenfalls die Ausbildung von Tubuli, die darüber hinaus gepaart sind mit einer atypischen Segregation von peroxisomalen Membran-proteinen. Ähnliche Membranveränderungen in Form von Perlenschnüren mit ausgeprägten Konstriktionen ließen sich auch durch Gabe von Peroxisomenproliferatoren in der Rattenleber induzieren. All diese Befunde, die zu einer Bildung von Tubuli führen, implizieren eine verhinderte Teilung der Peroxisomen. Aus den vorgestellten Daten lassen sich zwei Modelle entwickeln, die eine Coatomer-abhängige und eine Coatomer-unabhängige Vesikulierung der Peroxisomenmembran beschreiben. Dabei kann letzterer Prozeß als dreistufige Sequenz aus (i) Segregation von Membranproteinen, (ii) Ausbildung von Konstriktionen und (iii) Cytoskelett/DLP-1-vermittelter Membranabschnürung betrachtet werden. Zusammen mit jüngsten eigenen Beobachtungen, die eine Steuerung des peroxisomalen Phosphoinositid-Metabolismus durch ARF und Komponenten des Cytosols zeigen, weisen die hier vorliegenden Unter-suchungen der kleinen GTPase ARF bei den membrandynamischen Prozessen innerhalb der Vesikulierung von Peroxisomen eine zentrale Rolle zu

Review

+ mode

ATP- and GTP-dependent binding of NMM IIA heavy chain and b-actin to isolated rat liver peroxisomes.

<p>Organelles were incubated as indicated and floated up in a Nycodenz gradient. Three fractions were recovered from top to bottom (F1–F3). Binding is visualized by immunoblotting (A and C). ATP must be hydrolyzable for binding (E). Peroxisomes are localized in the gradient by the peroxisomal marker Pex11ap. Control incubations lacking peroxisomes do not show floatation of NMM IIA and b-actin (B, D, F) suggesting peroxisomal membranes to be required for binding.</p

Intracellular localization of Rab8a.

<p>Huh7 cells were stably transfected with dominant-active (GFP-Rab8aQ67L; A and J), dominant-inactive (GFP-Rab8aT22N; D and K) and wild type Rab8a (GFP-Rab8aWT; G) constructs. Peroxisomes were visualized by using primary anti-catalase (B, E and H) and Golgi cisternae were stained with primary anti-GM130 (J and K). Alexa FLUOR-labeled secondary antibodies were used for staining. Images were assembled from z-projections. The bar represents 10 mm. The quantitative evaluation of peroxisomes co-localizing with Rab8a following transfection of wild type and mutant Rab8a is shown in (L). n =  number of cells evaluated.</p

Particle-tracking analysis of GFP-SKL-marked peroxisomes in CHO cells.

<p>(A) Treatment of cells with <i>C. botulinum</i> toxin exoenzyme C3 (5 mg/ml, 24 h prior to analysis) known to inactivate RhoA significantly increases the number of peroxisomes moving long distances. (B) In cells expressing dominant-active V14-RhoA long-range movement is abolished and peroxisomal motility is indistinguishable to that in cells treated with nocodazole to depolymerize microtubules. Expression of dominant-active V26-RhoD does not show this effect. For clarity reasons the displacement graph of control peroxisomes expressing empty vector is omitted, as it is virtually identical to the control graph in (A).</p

Co-localization of RhoA and peroxisomes in AT3 mouse hepatoma cells.

<p>Endogenous (A, C) and transfected dominant-active myc-G14V-RhoA (D, F, red) co-localize to peroxisomes (C, F) visualized by the peroxisomal matrix protein catalase (B, E, green). At higher magnification (inset in F) a patchy distribution of RhoA on peroxisomes becomes apparent. Inactivation of RhoA by <i>C. botulinum</i> exoenzyme C3 abolishes RhoA localization to peroxisomes (G–I). Images were reproduced from single z-layers. The bars represent 10 mm.</p