Avenços metodològics en la detecció de virus entèrics en aigües

[cat] Els tres primers capítols es dediquen al desenvolupament i aplicació del mètode Viraden. En el primer es prova d'optimitzar el mètode basant-nos en la modificació del medi overlay, per addició d'ions multivalents i/o de tripsina-EDTA o per addició del compost iode-deoxiuridina (IDU) al cultiu cel·lular en creixement. L'addició d'IDU millora la recuperació d'enterovirus.El mètode Viraden pot aplicar-se per a la detecció de clapes víriques damunt els filtres d'èsters de cel·lulosa emprant diferents tècniques moleculars, la hibridació amb sondes d'àcid nucleic i la immunodetecció. Ambdues tècniques permeten la detecció de les zones de lisi sobre el suport però hi ha una manca en la capacitat d'identificació que permeti una classificació ràpida dels diferents enterovirus.L'adaptació del mètode Viraden a filtres de 90 mm de diàmetre permet una major aplicació del mètode per a diferents tipus de mostres ambientals.Es desenvolupen diferents sistemes de clarificació i descontaminació basats en agents químics i en membranes filtrants. La descontaminació amb fenol combinada amb clarificació per filtració a través de filtres de baixa adsorció proteica (PVDF) de 0,65 µm de diàmetre de porus és un bon sistema per a la descontaminació de mostres d'efluent secundari quan s'aplica posteriorment l'enumeració de virus pel mètode Viraden. La filtració a través de filtres esterilitzants (0,22 µm) de baixa adsorció proteica (PVDF o PES) és un mètode vàlid per a l'obtenció de mostres descontaminades. Per a volums grans de mostres d'efluent secundari, riu i mar es recomana la clarificació per filtració a través de filtres de 0,65 µm PVDF. Es valora la possibilitat d'aplicar el mètode Viraden per a la realització de test de desinfectants i antisèptics amb els virus adsorbits sobre un suport. Es compara l'acció de diferents desinfectants i antisèptics (clor, iode i glutaraldehid) sobre els virus adsorbits i en suspensió. Es detecta una diferència de 2 logaritmes entre els virus adsorbits i els virus en suspensió. Els virus adsorbits amb HR alta (>80%) persisteixen més que els virus en suspensió i aquests més que els virus adsorbits i mantinguts amb HR baixa (<50%). Es descriu un nou mètode d'enumeració de virus cultivables consistent en la realització d'una doble capa. Sobre un cultiu confluent de cèl·lules es disposa una barreja composta per la suspensió viral a analitzar, una suspensió cel·lular (igual o diferent a la de la monocapa) i el medi overlay que conté agar. El mètode es compara amb altres mètodes d'enumeració de virus i en tots els casos apareix com el mètode que permet una major recuperació de virus, tant en suspensions de cultius purs de diferents enterovirus com en mostres ambientals. Quan s'utilitza la línia cel·lular CaCo-2 per a la preparació de la suspensió cel·lular s'obtenen majors recomptes de virus a partir de mostres d'aigua residual bruta i el tipus de virus diferents que s'identifiquen a partir d'aquest tipus de mostra és major. Els virus cultivables sobre BGM en aigua residual bruta presenten increments en les densitats de virus durant els mesos de primavera. En aigua de mar els enterovirus correlacionen amb colifags somàtics (0,98). En el 76% de les mostres d'aigua de platja que compleixen amb els paràmetres microbiològics de qualitat bacteriològics inclosos a la Directiva 76/160/CEE es detecten enterovirus infecciosos en 10 litres. A partir dels aïllaments d'enterovirus de mostres ambientals es procedeix a la seva identificació mitjançant tècniques de RT-PCR i RFLP i els resultats mostren que es detecten serotips d'enterovirus dels grups poliovirus, echovirus i coxsackievirus B

Enteroviruses and Bacteriophages in Bathing Waters

A new procedure for detecting and counting enteroviruses based on the VIRADEN method applied to 10 liters of seawater was examined. It improved the efficiency of detection by taking into account both the number of positive isolations and numbers found with traditional methods. It was then used to quantify viruses in bathing waters. A number of bacterial indicators and bacteriophages were also tested. Cultivable enteroviruses were detected in 55% of the samples, most of which complied with bacteriological criteria. In contrast, viral genomes were only detected in 20% of the samples by reverse transcription-PCR. Somatic coliphages outnumbered all other indicators. F-specific RNA phages were detected in only 15% of the samples, whereas phages infecting Bacteroides thetaiotaomicron were detected in 70% of samples. A numerical relationship between the numbers of enteroviruses and the numbers of enterococci and somatic coliphages was observed. In situ inactivation experiments showed that viruses persisted significantly longer than the bacterial indicators. Only somatic coliphages and bacteriophages infecting Bacteroides persisted longer than the viruses. These results explain the numbers of enteroviruses and indicators in bathing waters attending the numbers usually found in sewage in the area. Somatic coliphages show a very good potential to predict the risk of viruses being present in bathing waters

Double-Layer Plaque Assay for Quantification of Enteroviruses

We describe here a double-layer plaque assay for the quantification of enteroviruses, combining a monolayer plaque assay and a suspended-cell plaque assay. The double-layer assay provides significantly greater counts than other methods of virus quantification of both suspensions of pure culture viruses and naturally occurring viruses. The counts obtained by this method are approximately one order of magnitude greater than those obtained with the more commonly used method, the monolayer plaque assay. We conclude that the methods available for quantifying viruses rank in efficiency as follows: double-layer plaque assay ≥ suspended-cell plaque assay > counting cytopathogenic virus adsorbed to cellulose nitrate membrane filters ≥ most probable number of cytopathogenic units > monolayer plaque assay. Moreover, the double-layer plaque assay allows the use of two different cell lines in the two layers. Using the human colonic carcinoma cell line CaCo2 facilitates the recovery of a greater number and diversity of naturally occurring enteroviruses in water than the monolayer agar method. In addition, the pretreatment of cells with 5-iodo-2′-deoxyuridine (IDU) prior to the quantification of enteroviruses by the double-layer plaque assay provides significantly higher recoveries than the use of IDU does with the other methods of quantification

Evaluation of Escherichia coli Host Strain CB390 for Simultaneous Detection of Somatic and F-Specific Coliphages▿

Escherichia coli WG5, the strain recommended by the International Organization for Standardization (ISO) to detect somatic coliphages, was transformed to F+ by introducing the plasmid Famp, which rendered it capable of simultaneously detecting both somatic and F-specific coliphages. Indeed, this strain, CB390, proved as effective in detecting similar numbers of phages as the sum of somatic and F-specific bacteriophages detected by the host strains recommended by both the ISO and the U.S. Environmental Protection Agency standardized methods

Survival of Bacterial Indicator Species and Bacteriophages after Thermal Treatment of Sludge and Sewage

The inactivation of naturally occurring bacterial indicators and bacteriophages by thermal treatment of a dewatered sludge and raw sewage was studied. The sludge was heated at 80°C, and the sewage was heated at 60°C. In both cases phages were significantly more resistant to thermal inactivation than bacterial indicators, with the exception of spores of sulfite-reducing clostridia. Somatic coliphages and phages infecting Bacteroides fragilis were significantly more resistant than F-specific RNA phages. Similar trends were observed in sludge and sewage. The effects of thermal treatment on various phages belonging to the three groups mentioned above and on various enteroviruses added to sewage were also studied. The results revealed that the variability in the resistance of phages agreed with the data obtained with the naturally occurring populations and that the phages that were studied were more resistant to heat treatment than the enteroviruses that were studied. The phages survived significantly better than Salmonella choleraesuis, and the extents of inactivation indicated that naturally occurring bacteriophages can be used to monitor the inactivation of Escherichia coli and Salmonella