Estudio del papel en la proliferación celular y en el metabolismo celular de la isoforma mitocondrial de la fosfoenolpiruvato carboxiquinasa (PEPCK-M) mediante edición genómica con CRISPR-Cas9

La fosfoenolpiruvato carboxiquinasa es una proteína clave del metabolismo celular al catalizar la reacción limitante de la gluconeogénesis. Cuenta con dos isoformas, citosólica y mitocondrial. El papel de esta última en el organismo no se conoce todavía en profundidad, por lo que su estudio resulta muy interesante. Una aproximación adecuada para tratar de elucidar su función es silenciarla mediante la técnica CRISPR-Cas9, una potente y novedosa herramienta de edición genética, dirigida específicamente a producir una deleción en el primer exón del gen que codifica para la proteína. Por una parte, los resultados muestran que la eficiencia de la técnica no ha sido muy buena, ya que de todos los clones seleccionados, solo dos muestran evidencias de deleción. Por otra parte, los efectos fenotípicos observados en el metabolismo no son muy significativos, al no haber grandes diferencias en la producción de glucosa en los clones silenciados con respecto al silvestre. Asimismo, no ha sido posible correlacionar el silenciamiento de la proteína con una proliferación celular alterada, ya que los clones positivos han resultado ser de crecimiento tanto rápido como lento, del mismo modo que clones negativos tenían bien crecimiento rápido, bien lento

Mecanismos moleculares de regulación de la actividad de la fosfoenolpiruvato carboxikinasa citosólica (pck1) y su aplicación al metabolismo lipídico en el cerdo

La mejora genética en el ganado porcino ha ido encaminada hacia la selección de canales magras. Para ello ha usado como criterio de selección el espesor de tocino dorsal, pero ha llevado aparejada la disminución del contenido de grasa intramuscular debido a la alta correlación genética (0,7) entre ambos caracteres. Un trabajo mostró que la sobreexpresión de la fosfoenolpiruvato carboxikinasa citosólica (Pck1) en músculo estriado de ratón aumentó el contenido de grasa intramuscular en un 400% a la vez que los depósitos adiposos visceral y subcutáneo disminuían a menos de la mitad, el fenotipo interesante para la cría de cerdos. La PCK1 cataliza una reacción reversible en la que el oxalacetato (OAA) es transformado a fosfoenolpiruvato (PEP). Esta enzima cataliza un paso limitante de la gluconeogénesis, se encuentra en un cruce de caminos de muchas rutas metabólicas y está implicada en el metabolismo de lípidos y proteínas así como en el de glúcidos. En el presente trabajo se muestra que el polimorfirmo c.A2456C en el exón 4 del gen de la Pck1 porcina está asociado a un descenso en el contenido de grasa intramuscular y un incremento del tocino dorsal. Además, este polimorfismo produce una sustitución Met139Leu en la proteína. El estudio de las propiedades cinéticas de ambas isoformas (salvaje y M139L) mostró que la variante M139L presentaba constantes cinéticas en favor de la reacción anaplerótica catalizada por Pck1. Además, la variante M139L mostró una menor capacidad gluconeogénica (30%) y lipogénica (9%) que la variante salvaje, mayor nivel de acetilación (40%) y mayor susceptibilidad a la degradación (20%) cuando se sobreexpresó en células HEK293T, que indican que el polimorfismo c.A2456C puede ser beneficioso en los programas de mejora animal.Dado que la Pck1 está fuertemente regulada a nivel transcripcional por, entre otros, el coactivador transcripcional PGC1α. El estudio de las sustituciones Pck1 c.A2456C y Pgc1α c.T1378A (descrita en un trabajo anterior y que produce una sustitución Cys430Ser en la proteína) mostró un efecto epistático entre ambas sustituciones. La sustitución Cys430Ser incrementa el nivel de O-glicosilación (O-GlcNAc) de Pgc1a p.C430S y de su estabilidad, pero va en detrimento de su su actividad transcripcional al disminuir la interacción con PPARgamma, promotor de la expresión de Pck1 y explicaría la menor inducción de la expresión de Pck1 por parte de la variante Pgc1a p.C430S.Aunque Pck1 está fuertemente regulada a nivel transcripcional, también presenta regulación post-traduccional. Se ha descrito que la Pck1 se acetila y se fosforila, aunque el papel de la fosforilación es desconocido. La Pck1 cataliza una reacción reversible, pero se desconocen los mecanismos por los que es regulada. En el presente trabajo se describe cómo la acetiltransferasa p300 es capa de acetilar Pck1 en condiciones de alta glucosa y favorecer la reacción reversa de Pck1 que convierte fosfoenolpiruvato en oxalacetato. La acetilación de la lisina 91 desestabiliza el sitio activo y favorece dicha reacción. En condiciones de baja energía, SIRT1 deacetila Pck1 y restaura las propiedades cinéticas de la enzima favoreciendo la reacción gluconeogénica. Además, la fosforilación dependiente de GSK3β favorece la ubiquitinación y degradación de Pck1 al mismo tiempo que disminuye el nivel de fosforilación. La fosforilación de la Ser90 en Pck1 favorece la deacetilación dependiente de SIRT1 en condiciones de baja energía. Los resultados de este trabajo muestran la capacidad de la acetilación de favorecer la actividad anaplerótica de la PCK1 suministrando metabolitos al ciclo de Krebs y el cruce de caminos entre la acetilación, fosforilación y ubiquitinación por el control del metabolismo central a través de Pck1. <br /

Self-acetylation at the active site of phosphoenolpyruvate carboxykinase (PCK1) controls enzyme activity

Acetylation is known to regulate the activity of cytosolic phosphoenolpyruvate carboxykinase (PCK1), a key enzyme in gluconeogenesis, by promoting the reverse reaction of the enzyme (converting phosphoenolpyruvate to oxaloacetate). It is also known that the histone acetyltransferase p300 can induce PCK1 acetylation in cells, but whether that is a direct or indirect function was not known. Here we initially set out to determine whether p300 can acetylate directly PCK1 in vitro. We report that p300 weakly acetylates PCK1, but surprisingly, using several techniques including protein crystallization, mass spectrometry, isothermal titration calorimetry, saturation-transfer difference nuclear magnetic resonance and molecular docking, we found that PCK1 is also able to acetylate itself using acetyl-CoA independently of p300. This reaction yielded an acetylated recombinant PCK1 with a 3-fold decrease in kcat without changes in Km for all substrates. Acetylation stoichiometry was determined for 14 residues, including residues lining the active site. Structural and kinetic analyses determined that site-directed acetylation of K244, located inside the active site, altered this site and rendered the enzyme inactive. In addition, we found that acetyl-CoA binding to the active site is specific and metal dependent. Our findings provide direct evidence for acetyl-CoA binding and chemical reaction with the active site of PCK1 and suggest a newly discovered regulatory mechanism of PCK1 during metabolic stress