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Estudio del papel en la proliferaci贸n celular y en el metabolismo celular de la isoforma mitocondrial de la fosfoenolpiruvato carboxiquinasa (PEPCK-M) mediante edici贸n gen贸mica con CRISPR-Cas9
La fosfoenolpiruvato carboxiquinasa es una prote铆na clave del metabolismo celular al catalizar la reacci贸n limitante de la gluconeog茅nesis. Cuenta con dos isoformas, citos贸lica y mitocondrial. El papel de esta 煤ltima en el organismo no se conoce todav铆a en profundidad, por lo que su estudio resulta muy interesante. Una aproximaci贸n adecuada para tratar de elucidar su funci贸n es silenciarla mediante la t茅cnica CRISPR-Cas9, una potente y novedosa herramienta de edici贸n gen茅tica, dirigida espec铆ficamente a producir una deleci贸n en el primer ex贸n del gen que codifica para la prote铆na. Por una parte, los resultados muestran que la eficiencia de la t茅cnica no ha sido muy buena, ya que de todos los clones seleccionados, solo dos muestran evidencias de deleci贸n. Por otra parte, los efectos fenot铆picos observados en el metabolismo no son muy significativos, al no haber grandes diferencias en la producci贸n de glucosa en los clones silenciados con respecto al silvestre. Asimismo, no ha sido posible correlacionar el silenciamiento de la prote铆na con una proliferaci贸n celular alterada, ya que los clones positivos han resultado ser de crecimiento tanto r谩pido como lento, del mismo modo que clones negativos ten铆an bien crecimiento r谩pido, bien lento
Mecanismos moleculares de regulaci贸n de la actividad de la fosfoenolpiruvato carboxikinasa citos贸lica (pck1) y su aplicaci贸n al metabolismo lip铆dico en el cerdo
La mejora gen茅tica en el ganado porcino ha ido encaminada hacia la selecci贸n de canales magras. Para ello ha usado como criterio de selecci贸n el espesor de tocino dorsal, pero ha llevado aparejada la disminuci贸n del contenido de grasa intramuscular debido a la alta correlaci贸n gen茅tica (0,7) entre ambos caracteres. Un trabajo mostr贸 que la sobreexpresi贸n de la fosfoenolpiruvato carboxikinasa citos贸lica (Pck1) en m煤sculo estriado de rat贸n aument贸 el contenido de grasa intramuscular en un 400% a la vez que los dep贸sitos adiposos visceral y subcut谩neo disminu铆an a menos de la mitad, el fenotipo interesante para la cr铆a de cerdos. La PCK1 cataliza una reacci贸n reversible en la que el oxalacetato (OAA) es transformado a fosfoenolpiruvato (PEP). Esta enzima cataliza un paso limitante de la gluconeog茅nesis, se encuentra en un cruce de caminos de muchas rutas metab贸licas y est谩 implicada en el metabolismo de l铆pidos y prote铆nas as铆 como en el de gl煤cidos. En el presente trabajo se muestra que el polimorfirmo c.A2456C en el ex贸n 4 del gen de la Pck1 porcina est谩 asociado a un descenso en el contenido de grasa intramuscular y un incremento del tocino dorsal. Adem谩s, este polimorfismo produce una sustituci贸n Met139Leu en la prote铆na. El estudio de las propiedades cin茅ticas de ambas isoformas (salvaje y M139L) mostr贸 que la variante M139L presentaba constantes cin茅ticas en favor de la reacci贸n anapler贸tica catalizada por Pck1. Adem谩s, la variante M139L mostr贸 una menor capacidad gluconeog茅nica (30%) y lipog茅nica (9%) que la variante salvaje, mayor nivel de acetilaci贸n (40%) y mayor susceptibilidad a la degradaci贸n (20%) cuando se sobreexpres贸 en c茅lulas HEK293T, que indican que el polimorfismo c.A2456C puede ser beneficioso en los programas de mejora animal.Dado que la Pck1 est谩 fuertemente regulada a nivel transcripcional por, entre otros, el coactivador transcripcional PGC1伪. El estudio de las sustituciones Pck1 c.A2456C y Pgc1伪 c.T1378A (descrita en un trabajo anterior y que produce una sustituci贸n Cys430Ser en la prote铆na) mostr贸 un efecto epist谩tico entre ambas sustituciones. La sustituci贸n Cys430Ser incrementa el nivel de O-glicosilaci贸n (O-GlcNAc) de Pgc1a p.C430S y de su estabilidad, pero va en detrimento de su su actividad transcripcional al disminuir la interacci贸n con PPARgamma, promotor de la expresi贸n de Pck1 y explicar铆a la menor inducci贸n de la expresi贸n de Pck1 por parte de la variante Pgc1a p.C430S.Aunque Pck1 est谩 fuertemente regulada a nivel transcripcional, tambi茅n presenta regulaci贸n post-traduccional. Se ha descrito que la Pck1 se acetila y se fosforila, aunque el papel de la fosforilaci贸n es desconocido. La Pck1 cataliza una reacci贸n reversible, pero se desconocen los mecanismos por los que es regulada. En el presente trabajo se describe c贸mo la acetiltransferasa p300 es capa de acetilar Pck1 en condiciones de alta glucosa y favorecer la reacci贸n reversa de Pck1 que convierte fosfoenolpiruvato en oxalacetato. La acetilaci贸n de la lisina 91 desestabiliza el sitio activo y favorece dicha reacci贸n. En condiciones de baja energ铆a, SIRT1 deacetila Pck1 y restaura las propiedades cin茅ticas de la enzima favoreciendo la reacci贸n gluconeog茅nica. Adem谩s, la fosforilaci贸n dependiente de GSK3尾 favorece la ubiquitinaci贸n y degradaci贸n de Pck1 al mismo tiempo que disminuye el nivel de fosforilaci贸n. La fosforilaci贸n de la Ser90 en Pck1 favorece la deacetilaci贸n dependiente de SIRT1 en condiciones de baja energ铆a. Los resultados de este trabajo muestran la capacidad de la acetilaci贸n de favorecer la actividad anapler贸tica de la PCK1 suministrando metabolitos al ciclo de Krebs y el cruce de caminos entre la acetilaci贸n, fosforilaci贸n y ubiquitinaci贸n por el control del metabolismo central a trav茅s de Pck1. <br /
Self-acetylation at the active site of phosphoenolpyruvate carboxykinase (PCK1) controls enzyme activity
Acetylation is known to regulate the activity of cytosolic phosphoenolpyruvate carboxykinase (PCK1), a key enzyme in gluconeogenesis, by promoting the reverse reaction of the enzyme (converting phosphoenolpyruvate to oxaloacetate). It is also known that the histone acetyltransferase p300 can induce PCK1 acetylation in cells, but whether that is a direct or indirect function was not known. Here we initially set out to determine whether p300 can acetylate directly PCK1 in vitro. We report that p300 weakly acetylates PCK1, but surprisingly, using several techniques including protein crystallization, mass spectrometry, isothermal titration calorimetry, saturation-transfer difference nuclear magnetic resonance and molecular docking, we found that PCK1 is also able to acetylate itself using acetyl-CoA independently of p300. This reaction yielded an acetylated recombinant PCK1 with a 3-fold decrease in kcat without changes in Km for all substrates. Acetylation stoichiometry was determined for 14 residues, including residues lining the active site. Structural and kinetic analyses determined that site-directed acetylation of K244, located inside the active site, altered this site and rendered the enzyme inactive. In addition, we found that acetyl-CoA binding to the active site is specific and metal dependent. Our findings provide direct evidence for acetyl-CoA binding and chemical reaction with the active site of PCK1 and suggest a newly discovered regulatory mechanism of PCK1 during metabolic stress