Desarrollo de estrategias de ingeniería de tejidos para la regeneración ósteo-cartilaginosa

La ingeniería de tejidos es una ciencia multidisciplinaria que involucra el diseño y desarrollo de biomateriales que puedan funcionar como sustitutos biológicos para la reparación o sustitución de tejidos u órganos dañados. Este enfoque evita el gran inconveniente de las técnicas de implantes como la escasez de donantes de tejidos y órganos, el rechazo inmunológico, entre otros. La evidencia acumulada hasta este momento ha demostrado que la estrategia basada en el uso de matrices tridimensionales (scaffolds) para ingeniería de tejidos tiene potencial para ser utilizada en la regeneración de una serie de tejidos y órganos y, en particular, es una alternativa prometedora para la reparación de lesiones osteocondrales, ya que podría utilizarse para regenerar tanto el hueso subcondral y el cartílago articular así como la interfaz hueso-cartílago.La hipótesis de este trabajo es que la combinación de materiales naturales y sintéticos permite lograr materiales con propiedades fisicoquímicas y biológicas adecuadas para la regeneración ósteo-cartilaginosa. Para probar nuestra hipótesis, diseñamos y desarrollamos un biomaterial, basado en un polímero sintético derivado de un polifumarato compatibilizado con un polímero natural (quitosano), el cual se estudió in vitro con distintos linajes celulares e in vivo en animales de experimentación, con el fin de evaluar su potencial aplicación como scaffold para la reparación de lesiones osteocondrales. Esta mezcla compatibilizada de polímeros permite combinar las ventajas de cada tipo de material. En particular, el quitosano presenta muy buena biocompatibilidad y baja citotoxicidad pero sus propiedades mecánicas y tasa de degradación no son las adecuadas para su aplicación en ingeniería tejidos óseo o cartilaginoso; mientras que los polímeros derivados de polifumarato han demostrado presentar mejores propiedades mecánicas y tasa de degradación regulable por la selección adecuada de la composición de comonómeros, pero poseen menor biocompatibilidad, motivo por el cual necesitan combinarse con otros materiales en vista a su aplicación. Como primer objetivo se propuso sintetizar un copolímero fumárico por copolimerización radical empleando energía de microondas a partir de acetato de vinilo y fumarato de diisopropilo, el mismo fue caracterizado utilizando diversas técnicas como: cromatografía de exclusión molecular (SEC), espectroscopia infrarroja con transformadas de Fourier (FTIR), resonancia magnética nuclear de protones (1H-RMN), calorimetría diferencial de barrido (DSC) y análisis termogravimétrico (TGA). Este copolímero se compatibilizó con quitosano por entrecruzamiento con adición de bórax. El biomaterial obtenido (PFVH-CHI-B) fue estudiado por espectroscopia infrarroja con transformadas de Fourier y sistema de reflectancia total atenuada (ATR-FTIR), microscopia electrónica de barrido (SEM), DSC y TGA. Además, se realizaron pruebas mecánicas, de hinchamiento y de degradación; encontrándose propiedades mecánicas del orden de las propias del hueso trabecular, un comportamiento de hinchamiento comparable con un hidrogel (como lo es el cartílago) y una buena tasa de degradación. Además, el material mostró una buena capacidad de estructuración logrando obtener scaffolds tanto por solvent casting o liofilización como por nanoestructuración mediante la infiltración en plantilla de óxido de aluminio anodizado (AAO) de distintas dimensiones. En particular, los scaffolds nanoestructurados presentaron una morfología de nanofibras homogénea como se demostró mediante SEM y espectroscopía Raman.A continuación, se realizaron estudios in vitro que mostraron que tanto el material obtenido por solvent casting (SC) como el nanoestructurado (SN) presentaban una muy buena biocompatibilidad, permitiendo la adhesión, proliferación y la diferenciación osteogénica de células progenitoras de médula ósea (CPMO), como así también el crecimiento de condrocitos primarios y la deposición de la matriz extracelular cartilaginosa. Estos resultados fueron demostrados mediante ensayos bioquímicos y la expresión de diferentes marcadores de fenotipo específicos evaluados por la reacción en cadena de la polimerasa con transcriptasa inversa (RT-PCR). Estos estudios in vitro mostraron además, que el cambio en la topografía de la superficie del scaffolds tiene influencia sobre el crecimiento y la diferenciación celular. Por otro lado, se evaluó la capacidad de producir respuesta inflamatoria, como medida de citotoxicidad, empleando un modelo de macrófagos en cultivo, encontrando que ni el material ni su nanoestructuración presentaban evidencias de efectos citotóxicos. Por último, para evaluar este biomaterial como sustituto óseo se empleó un modelo in vivo de lesión en calotas de ratas. Para ello, se realizó un defecto de craneotomía en cada hueso parietal, en el cual se implantó el biomaterial estructurado por liofilización. Luego de 30 días post-cirugía, se realizó una evaluación histológica donde se encontró una buena regeneración del tejido e integración de las células con el scaffold sin signos que evidencien el rechazo de dicho material. En conjunto, nuestros resultados indican que el biomaterial desarrollado combina adecuadamente las propiedades de los polímeros individuales, desde el punto de vista tanto fisicoquímico como de biocompatibilidad, mostrando su potencialidad en la regeneración ósteo-cartilaginosa.Fil: Lastra, María Laura. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Centro Científico Tecnológico Conicet - La Plata. Instituto de Investigaciones Fisicoquímicas Teóricas y Aplicadas. Universidad Nacional de La Plata. Facultad de Ciencias Exactas. Instituto de Investigaciones Fisicoquímicas Teóricas y Aplicadas; Argentina. Universidad Nacional de La Plata. Facultad de Ciencias Exactas. Departamento de Ciencias Biológicas. Laboratorio de Investigación en Osteospatías y Metabolismo Mineral; Argentina. Instituto en Ciencia y Tecnología de Polímeros; Españ

Fumarate Copolymer–Chitosan Cross-Linked Scaffold Directed to Osteochondrogenic Tissue Engineering

Natural and synthetic cross-linked polymers allow the improvement of cytocompatibility and mechanical properties of the individual polymers. In osteochondral lesions of big size it will be required the use of scaffolds to repair the lesion. In this work a borax cross-linked scaffold based on fumarate-vinyl acetate copolymer and chitosan directed to osteochondrondral tissue engineering is developed. The cross-linked scaffolds and physical blends of the polymers are analyzed in based on their morphology, glass transition temperature, and mechanical properties. In addition, the stability, degradation behavior, and the swelling kinetics are studied. The results demonstrate that the borax cross-linked scaffold exhibits hydrogel behavior with appropriated mechanical properties for bone and cartilage tissue regeneration. Bone marrow progenitor cells and primary chondrocytes are used to demonstrate its osteo- and chondrogenic properties, respectively, assessing the osteoand chondroblastic growth and maturation, without evident signs of cytotoxicity as it is evaluated in an in vitro system.Instituto de Investigaciones Fisicoquímicas Teóricas y AplicadasLaboratorio de Investigación en Osteopatías y Metabolismo Minera

Biocompatibilidad de matrices basadas en polifumaratos para regeneración del tejido ósteo-cartilaginoso

Con los métodos disponibles hasta el momento para la reconstrucción de tejidos, la reparación de defectos del tejido cartilaginoso no ha sido alcanzada completamente. Por esta razón, se ha recurrido a la ingeniería de tejidos, que busca el desarrollo de estrategias para obtener sustitutos funcionales de tejido cartilaginoso, con el fin de ofrecer soluciones terapéuticas a pacientes con pérdida o daño de este tipo de tejido. Con este objetivo un polímero determinado puede adaptarse para la restauración del tejido dependiendo de la apropiada selección de sus co-monómeros o de su interacción con otro polímero mediante un proceso de entrecruzamiento. Nuestro grupo trabaja desde hace algunos años en técnicas de ingeniería de tejido óseo. Hemos desarrollado y caracterizado diferentes matrices poliméricas naturales o sintéticas con o sin el agregado de drogas para la reparación del hueso. Anteriormente mostramos los resultados de la síntesis y caracterización de matrices basadas en un copolímero acetato de vinilo (AcV)-fumarato de diisopropilo (FIP) entrecruzado con quitosano. También encontramos que células progenitoras de médula ósea (CPMO) crecieron sobre las matrices de manera comparable con la condición control (plato de cultivo). Además estudiamos la diferenciación osteoblástica en estas superficies y vimos que tanto la producción de colágeno tipo I como la mineralización de la matriz se incrementó de manera significativa en las CPMO crecidas sobre la membrana comparada con la condición control. En este trabajo presentamos los resultados de los ensayos de biocompatibilidad para estas membranas y su posible aplicación para la regeneración del tejido cartilaginoso. Para los ensayos se empleó un cultivo primario de condrocitos aislados de ratas Sprage-Dowley. Se estudió la adhesión (una hora) y proliferación (1, 2 y 7 días) de estas células sobre las matrices por el ensayo colorimétrico de MTT (Bromuro de 3-(4,5- dimetiltiazol-2-ilo)-2,5-difeniltetrazol). Para evaluar la producción de la matriz propia del tejido cartilaginoso se dejaron las células creciendo sobre la membrana luego de llegar confluencia durante 14 días y se midió la producción de glicosaminoglicanos (GAG) por el ensayo colorimétrico de azul de Alcian. Además estudiamos el swelling y la estabilidad de las matrices en buffer fosfato (pH 7,4). Nuestros resultados mostraron que la cinética de proliferación de los condrocitos sobre las membranas era comparable a la condición control  (células crecidas directamente sobre el plato de cultivo) y que las células conservan su capacidad de producción de GAG aun creciendo sobre la membrana, aunque en menor porcentaje comparado con el control. Las matrices presentaron un hinchamiento característico de los hidrogeles (400% de hinchamiento a 60 minutos) y además mostraron una muy buena estabilidad en buffer fosfato, perdida en peso seco de 5% a los dos meses. Estos estudios preliminares indicarían que las membranas serían aptas para una adecuada regeneración del tejido ósteo-cartilaginoso

Biocompatibilidad de matrices basadas en polifumaratos para regeneración del tejido ósteo-cartilaginoso

Con los métodos disponibles hasta el momento para la reconstrucción de tejidos, la reparación de defectos del tejido cartilaginoso no ha sido alcanzada completamente. Por esta razón, se ha recurrido a la ingeniería de tejidos, que busca el desarrollo de estrategias para obtener sustitutos funcionales de tejido cartilaginoso, con el fin de ofrecer soluciones terapéuticas a pacientes con pérdida o daño de este tipo de tejido. Con este objetivo un polímero determinado puede adaptarse para la restauración del tejido dependiendo de la apropiada selección de sus co-monómeros o de su interacción con otro polímero mediante un proceso de entrecruzamiento. Nuestro grupo trabaja desde hace algunos años en técnicas de ingeniería de tejido óseo. Hemos desarrollado y caracterizado diferentes matrices poliméricas naturales o sintéticas con o sin el agregado de drogas para la reparación del hueso. Anteriormente mostramos los resultados de la síntesis y caracterización de matrices basadas en un copolímero acetato de vinilo (AcV)-fumarato de diisopropilo (FIP) entrecruzado con quitosano. También encontramos que células progenitoras de médula ósea (CPMO) crecieron sobre las matrices de manera comparable con la condición control (plato de cultivo). Además estudiamos la diferenciación osteoblástica en estas superficies y vimos que tanto la producción de colágeno tipo I como la mineralización de la matriz se incrementó de manera significativa en las CPMO crecidas sobre la membrana comparada con la condición control.En este trabajo presentamos los resultados de los ensayos de biocompatibilidad para estas membranas y su posible aplicación para la regeneración del tejido cartilaginoso. Para los ensayos se empleó un cultivo primario de condrocitos aislados de ratas Sprage-Dowley. Se estudió la adhesión (una hora) y proliferación (1, 2 y 7 días) de estas células sobre las matrices por el ensayo colorimétrico de MTT (Bromuro de 3-(4,5- dimetiltiazol-2-ilo)-2,5-difeniltetrazol). Para evaluar la producción de la matriz propia del tejido cartilaginoso se dejaron las células creciendo sobre la membrana luego de llegar confluencia durante 14 días y se midió la producción de glicosaminoglicanos (GAG) por el ensayo colorimétrico de azul de Alcian. Además estudiamos el swelling y la estabilidad de las matrices en buffer fosfato (pH 7,4).Nuestros resultados mostraron que la cinética de proliferación de los condrocitos sobre las membranas era comparable a la condición control  (células crecidas directamente sobre el plato de cultivo) y que las células conservan su capacidad de producción de GAG aun creciendo sobre la membrana, aunque en menor porcentaje comparado con el control. Las matrices presentaron un hinchamiento característico de los hidrogeles (400% de hinchamiento a 60 minutos) y además mostraron una muy buena estabilidad en buffer fosfato, perdida en peso seco de 5% a los dos meses.Estos estudios preliminares indicarían que las membranas serían aptas para una adecuada regeneración del tejido ósteo-cartilaginoso.Facultad de Ciencias Exacta

Biocompatibilidad de matrices basadas en polifumaratos para regeneración del tejido ósteo-cartilaginoso

Con los métodos disponibles hasta el momento para la reconstrucción de tejidos, la reparación de defectos del tejido cartilaginoso no ha sido alcanzada completamente. Por esta razón, se ha recurrido a la ingeniería de tejidos, que busca el desarrollo de estrategias para obtener sustitutos funcionales de tejido cartilaginoso, con el fin de ofrecer soluciones terapéuticas a pacientes con pérdida o daño de este tipo de tejido. Con este objetivo un polímero determinado puede adaptarse para la restauración del tejido dependiendo de la apropiada selección de sus co-monómeros o de su interacción con otro polímero mediante un proceso de entrecruzamiento. Nuestro grupo trabaja desde hace algunos años en técnicas de ingeniería de tejido óseo. Hemos desarrollado y caracterizado diferentes matrices poliméricas naturales o sintéticas con o sin el agregado de drogas para la reparación del hueso. Anteriormente mostramos los resultados de la síntesis y caracterización de matrices basadas en un copolímero acetato de vinilo (AcV)-fumarato de diisopropilo (FIP) entrecruzado con quitosano. También encontramos que células progenitoras de médula ósea (CPMO) crecieron sobre las matrices de manera comparable con la condición control (plato de cultivo). Además estudiamos la diferenciación osteoblástica en estas superficies y vimos que tanto la producción de colágeno tipo I como la mineralización de la matriz se incrementó de manera significativa en las CPMO crecidas sobre la membrana comparada con la condición control.En este trabajo presentamos los resultados de los ensayos de biocompatibilidad para estas membranas y su posible aplicación para la regeneración del tejido cartilaginoso. Para los ensayos se empleó un cultivo primario de condrocitos aislados de ratas Sprage-Dowley. Se estudió la adhesión (una hora) y proliferación (1, 2 y 7 días) de estas células sobre las matrices por el ensayo colorimétrico de MTT (Bromuro de 3-(4,5- dimetiltiazol-2-ilo)-2,5-difeniltetrazol). Para evaluar la producción de la matriz propia del tejido cartilaginoso se dejaron las células creciendo sobre la membrana luego de llegar confluencia durante 14 días y se midió la producción de glicosaminoglicanos (GAG) por el ensayo colorimétrico de azul de Alcian. Además estudiamos el swelling y la estabilidad de las matrices en buffer fosfato (pH 7,4).Nuestros resultados mostraron que la cinética de proliferación de los condrocitos sobre las membranas era comparable a la condición control  (células crecidas directamente sobre el plato de cultivo) y que las células conservan su capacidad de producción de GAG aun creciendo sobre la membrana, aunque en menor porcentaje comparado con el control. Las matrices presentaron un hinchamiento característico de los hidrogeles (400% de hinchamiento a 60 minutos) y además mostraron una muy buena estabilidad en buffer fosfato, perdida en peso seco de 5% a los dos meses.Estos estudios preliminares indicarían que las membranas serían aptas para una adecuada regeneración del tejido ósteo-cartilaginoso.Facultad de Ciencias Exacta

Fumarate copolymer–chitosan cross-linked scaffold directed to osteochondrogenic tissue engineering

Natural and synthetic cross-linked polymers allow the improvement of cytocompatibility and mechanical properties of the individual polymers. In osteochondral lesions of big size it will be required the use of scaffolds to repair the lesion. In this work a borax cross-linked scaffold based on fumarate-vinyl acetate copolymer and chitosan directed to osteochondrondral tissue engineering is developed. The cross-linked scaffolds and physical blends of the polymers are analyzed in based on their morphology, glass transition temperature, and mechanical properties. In addition, the stability, degradation behavior, and the swelling kinetics are studied. The results demonstrate that the borax cross-linked scaffold exhibits hydrogel behavior with appropriated mechanical properties for bone and cartilage tissue regeneration. Bone marrow progenitor cells and primary chondrocytes are used to demonstrate its osteo- and chondrogenic properties, respectively, assessing the osteoand chondroblastic growth and maturation, without evident signs of cytotoxicity as it is evaluated in an in vitro system

Nanostructured fumarate copolymer-chitosan crosslinked scaffold: an in vitro osteochondrogenesis regeneration study

In the tissue engineering field, the design of the scaffold inspired on the natural occurring tissue is of vital importance. Ideally, the scaffold surface must promote cell growth and differentiation, while promote angiogenesis in the in vivo implant of the scaffold. On the other hand, the material selection must be biocompatible and the degradation times should meet tissue reparation times. In the present work, we developed a nanofibrous scaffold based on chitosan crosslinked with diisopropylfumarate-vinyl acetate copolymer using anodized aluminum oxide (AAO) templates. We have previously demonstrated its biocompatibility properties with low cytotoxicity and proper degradation times. Now, we extended our studies to demonstrate that it can be successfully nanostructured using the AAO templates methodology, obtaining a nanorod-like scaffold with a diameter comparable to those of collagen fibers of the bone matrix (170 and 300 nm). The nanorods obtained presented a very homogeneous pattern in diameter and length, and supports cell attachment and growth. We also found that both osteoblastic and chondroblastic matrix production were promoted on bone marrow progenitor cells and primary condrocytes growing on the scaffolds, respectively. In addition, the nanostructured scaffold presented no cytotoxicity as it was evaluated using a model of macrophages on culture

Tautomerizable β-ketonitrile copolymers for bone tissue engineering: Studies of biocompatibility and cytotoxicity

β-Ketonitrile tautomeric copolymers have demonstrated tunable hydrophilicity/hydrophobicity properties according to surrounding environment, and mechanical properties similar to those of human bone tissue. Both characteristic properties make them promising candidates as biomaterials for bone tissue engineering. Based on this knowledge we have designed two scaffolds based on β-ketonitrile tautomeric copolymers which differ in chemical composition and surface morphology. Two of them were nanostructured, using an anodized aluminum oxide (AAO) template, and the other two obtained by solvent casting methodology. They were used to evaluate the effect of the composition and their structural modifications on the biocompatibility, cytotoxicity and degradation properties. Our results showed that the nanostructured scaffolds exhibited higher degradation rate by macrophages than casted scaffolds (6 and 2.5% of degradation for nanostructured and casted scaffolds, respectively), a degradation rate compatible with bone regeneration times. We also demonstrated that the β-ketonitrile tautomeric based scaffolds supported osteoblastic cell proliferation and differentiation without cytotoxic effects, suggesting that these biomaterials could be useful in the bone tissue engineering field.Facultad de Ciencias ExactasLaboratorio de Investigación en Osteopatías y Metabolismo MineralInstituto de Investigaciones Fisicoquímicas Teóricas y AplicadasLaboratorio de Estudio de Compuestos Orgánico

Estratificación de riesgo cardiovascular en enfermedades autoinmunes en un hospital universitario

Introducción: Las enfermedades autoinmunes (EAI) han sido consideradas como no fatales; sin embargo, la mayoría de éstas tienen una historia natural de mortalidad prematura. Algunas como el lupus eritematoso sistémico (LES), artritis reumatoidea (AR), esclerosis sistémica (ES), polimiositis, vasculitis y otras, están asociadas a una mortalidad temprana comparable a las enfermedades cardiovasculares y neoplásicas. Objetivos: 1- Identificar las EAI con mayor riesgo cardiovascular previamente diagnosticadas en pacientes que sean atendidos en un servicio de Reumatología de un hospital universitario. 2- Comparar el riesgo cardiovascular calculado según la escala de Framingham y el modelo SCORE en pacientes con diagnóstico previo de enfermedad autoinmune. Material y métodos: Estudio analítico de corte transversal, en un servicio de Reumatología de un hospital universitario donde se reclutaron 129 historias clínicas de pacientes que acudieron espontáneamente entre el 1 de noviembre de 2010 y el 31 de mayo de 2011. Se elaboraron tablas de cruces de variables y su posterior cálculo con Chi Cuadrado y coeficiente de Pearson. Resultados: Las EAI con mayor riesgo cardiovascular fueron AR, vasculitis y EASN. La escala de Framingham mostró solo un paciente con AR que tenía RCV muy elevado. La vasculitis encabezó el RCV elevado con el 16,7%, pero esto corresponde solo a un paciente. El segundo lugar estaba representado por AR (10,7%), luego EASN (10%) y LES (4,5%). El modelo SCORE demostró que el 3,1% de las enfermedades tenía muy elevado RCV, porcentaje que estaba comprendido por 3 pacientes con AR y 1 con vasculitis. El RCV elevado estuvo representado sólo por AR en un 13,3%. Al comparar ambas escalas de riesgo cardiovascular, el 70,5% de 129 pacientes presentaron bajo RCV. Sólo un paciente (0,8%) con bajo RCV en la escala de Framingham tenía muy elevado RCV en el SCORE. De acuerdo al coeficiente de correlación R de Pearson existe un nivel de asociación de casi el 50%, por lo tanto, se demostró que existe muy buena correspondencia entre estas variables. Conclusión: Se encontró una correlación positiva entre las dos escalas, y las enfermedades con mayor riesgo cardiovascular fueron la AR, vasculitis y EASN, destacando el bajo número de casos de las últimas dos comparadas con la AR. Notoriamente el nivel de evidencia es mayor en AR y en LES que en cualquier otra patología autoinmune. Esto no descarta que el resto de ellas posea alto RCV. Futuros trabajos multicéntricos deberían plantearse para el desarrollo de guías destinadas al resto de las enfermedades autoinmunes o para la aplicación de las ya existentes

Bioequivalence Study of Two Long-Acting Formulations of Oxytetracycline Following Intramuscular Administration in Bovines

The aim of this study was to evaluate the bioequivalence of two commercial long-acting formulations based on oxytetracycline (OTC) hydrochloride between the reference formulation (Terramycin LA, Pfizer) and a test formulation (Cyamicin LA, Fort Dodge Saude Animal). Both formulations were administered in a single intramuscular route at a dose of 20 mg OTC/kg of body weight in clinically healthy bovines. The study was carried out according to a one-period parallel design. Plasma samples were analyzed by high-pressure liquid chromatography. The limit of quantitation was 0.050 μg/mL with an accuracy of 101.67% with a coefficient of variation of 13.15%. Analysis of variance and 90% confidence interval tests were used to compare the bioavailability parameters (maximum plasma concentration, Cmax, and the area under the concentration-versus-time curve extrapolated to infinity, AUC0-∞) of both products. In the case of the time to maximum concentration (Tmax), non-parametric tests based on Wilcoxon's signed rank test were preferred. The comparison of the mean AUC0-∞ values did not reveal any significant differences (311.40 ± 93.05 μg h/mL and 287.71 ± 45.31 μg h/mL, respectively). The results were similar for the Tmax (3.58 ± 0.90 h versus 3.42 ± 0.51 h). However, when comparing the mean Cmax some significant differences were found (8.73 ± 3.66 μg/mL and 10.43 ± 3.84 μg/mL, respectively). The 90% confidence intervals for the ratio of AUC0-∞ and Tmax values for the reference and test product are within the interval 80-125%, but the 90% confidence intervals for the ratio of Cmax falls outside the proposed interval. It was concluded that Cmax of test product are not within the 20% of those of the reference, thus suggesting that test OTC is not bioequivalent to the reference formulation. Keywords: oxytetracycline, pharmacokinetics, AUC, Cmax, Tmax, bioequivalence, bovine