Etablierung und Anwendung von molekular‐zytogenetischen Methoden an reproduktionsgenetischen und klinisch‐genetischen Fragestellungen

Diese Arbeit beruht auf fünf Teilprojekten (ein reproduktionsgenetisches und vier klinischgenetische).Im Rahmen des reproduktionsgenetischen Projekts wurde ein Schnell-CGH-Protokoll zur Einzelzell- und Polkörperanalyse entwickelt, indem jeder Schritt des konventionellen CGHProtokolls verändert bzw. verkürzt worden war, so dass die Durchführung von einem Zeitraum von 72 h auf 16 h reduziert werden konnte. Die Technik ermöglicht die simultane Analyse aller Chromosomen in einem Experiment. Das etablierte Protokoll wurde an verschiedenen Fragestellungen validiert und zeigte zuverlässige Ergebnisse, so dass es sich sowohl für eine pränataldiagnostische Anwendung, als auch in der Polkörperdiagnostik eignet. Durch Anwendung des Protokolls an Einzelzellen mit bekannten Trisomien 18 und 21 konnten Gewinne der Chromosomen 18 bzw. 21 detektiert werden. Außerdem wurde das Protokoll an 32 ersten Polkörpern von 16 Patientinnen im Alter von 33 bis 44 Jahren, die hauptsächlich aufgrund von erhöhtem mütterlichen Alter und wiederholtem Implantationsversagen in Behandlung waren, angewandt. Es wurde eine Aneuploidierate von 75 % detektiert, die fast alle Chromosomen betraf (Landwehr et al. 2008). Das erste klinisch-genetische Teilprojekt betraf Patienten mit mentaler Retardierung (MR), die etwa 2-3 % der Bevölkerung ausmachen, wobei die Ursache in 50 % der Fälle ungeklärt bleibt. In dieser Studie wurden mittels genomweiter array-basierter CGH, die das Genom mit einer Auflösung von 0,5 Mb abdeckte, Mikrodeletionen und Mikroduplikationen als Ursache für die MR in 10 % der 60 Fälle mit unklarer Ätiologie identifiziert. Es wurden entweder aufgrund der vollständigen Abdeckung der Region auf den DNA-Chips oder mittels FISH-Analysen exakte Bruchpunkte der Alterationen bestimmt, um deletierte oder duplizierte Gene, die möglicherweise Einfluss auf den MR-Phänotyp haben, zu identifizieren. Bei sechs Patienten konnten Mikroimbalancen detektiert werden, die vermutlich kausativ für deren Phänotyp waren. Fünf Patienten mit MR, fazialen Dysmorphien, neurologischen Auffälligkeiten (drei Fälle), Hirnanomalien (zwei Fälle) und Wachstumsstörungen (zwei Fälle) wiesen Mikrodeletionen in den chromosomalen Banden 6q11.1-q13 (10,8 Mb), Xq21.31-q21.33 (4,0 Mb), 1q24.1-q24.2 (3,8 Mb), 19p13.12 (2,1 Mb) bzw. 4p12-p13 (1,1 Mb) auf. Eine Mikroduplikation wurde in 22q11.2 (2,8 Mb) bei einer Patientin mit milder MR, Mikrozephalie und Dysmorphien detektiert. Drei der Aberrationen entstanden de novo, während zwei ererbt worden waren (Engels, Brockschmidt, Hoischen, Landwehr et al. 2007). Im zweiten klinisch-genetischen Projekt wurde eine Patientin untersucht, bei der klinisch ein Pitt-Hopkins Syndrom (PHS) diagnostiziert worden war. Ihr klinisches Bild (schwere MR ohne Sprachentwicklung, Atmungsanomalien, bestimmte faziale Dysmorphien) stimmte mit zuvor beschriebenen PHS-Patienten überein. Wenn sich die Atmungsanomalien, die ein charakteristisches Merkmal darstellen, spät manifestieren, kann es zu einer Verzögerung der Diagnosestellung kommen. Bei der Patientin wurde mittels Array-CGH und FISH-Analysen eine de novo Mikrodeletion von annähernd 0,5 Mb in Chromosom 18q21.2 detektiert, die lediglich ein bekanntes Gen, den Transkriptionsfaktor TCF4, beinhaltete. Wir konnten mittels RT-PCR-Analyse zeigen, dass die Mikrodeletion unserer Patientin zu einer funktionellen Haploinsuffizienz von TCF4 führt und somit dieses als PHS-Gen bestätigen. Dieses Ergebnis wurde unabhängig voneinander von zwei anderen Gruppen (Zweier et al. 2007; Amiel et al. 2007) beschrieben. Nach der Identifizierung des Gens ist es nun möglich, die klinische Diagnose des PHS mittels genetischer Testung zu bestätigen. Da sowohl größere Umbauten, die das gesamte TCF4-Gen umfassen, als auch Punktmutationen in diesem Gen beschrieben wurden, sollten bei Verdacht auf ein PHS MLPA-Untersuchungen und Sequenzierungen des Gens durchgeführt werden (Brockschmidt, Todt, Ryu, Hoischen, Landwehr et al. 2007). Im dritten klinisch-genetischen Teilprojekt wurde ein Kollektiv von zehn Patienten mit ungeklärten syndromalen Nephropathien, die renale und extrarenale Symptome aufwiesen und keinem bekannten Syndrom zugeordnet werden konnten, untersucht werden. Durch die Untersuchung dieser Patienten mittels array-basierter CGH konnten wir zeigen, dass es sich um eine geeignete Methode handelt, um genetische Ursachen syndromaler Nephropathien zu identifizieren und eine Diagnose zu stellen. Eine Patientin, ein 14-jähriges Mädchen, wies ein contiguous gene Syndrom in Chromosom Xq22.3-q23 auf, das in dieser Form zuvor noch nicht beschrieben worden war. Die 3,3 Mb große, de novo entstandene Mikrodeletion wurde mit FISH und MLPA-Analysen verifiziert und enthielt das X-chromosomale Alport-Syndrom Gen COL4A5, die MR-Gene FACL4 und PAK3 und Teile des DCX-Gens, das mit double cortex-Bildung, MR und Epilepsie assoziiert ist. Der Phänotyp unserer Patientin vereint damit Aspekte des Alport-MR contiguous gene Syndroms mit double cortex und Epilepsie (Hoischen, Landwehr et al. 2009). Im vierten klinisch-genetischen Projekt ermöglichte die array-basierte CGH in einem Kollektiv von 30 Patienten, die sowohl kongenitale Anomalien der Nieren und ableitenden Harnwege (CAKUT) als auch zusätzliche extrarenale Symptome aufwiesen, die Kartierung von vier chromosomalen Regionen, die mit dem CAKUT-Phänotyp assoziiert sind. Bei einem Patienten und seinem Bruder fanden sich ein terminaler Verlust von 0,59 Mb in 1q44 und ein Gewinn von 6,55 Mb in 16q23.3-q24.3. Diese Imbalancen können bei der Entstehung einer Hypospadie eine Rolle spielen. Eine FISH-Analyse zeigte, dass die Aberrationen der Patienten auf eine vorliegende unbalancierte 1;16-Translokation zurückzuführen waren. Der gesunde Vater der beiden Patienten wies eine balancierte 1;16-Translokation auf. Außerdem wurde bei einem Patienten eine 11,93 Mb große Deletion der Region 3q23-25.1 detektiert und es konnte gezeigt werden, dass diese Deletion, die das AGTR1-Gen enthält, mit einer renalen Dysplasie und einer Hydronephrose einhergehen kann, so dass eine Haploinsuffizienz von AGTR1 kausativ für den renalen Phänotyp sein könnte. Da bei einem CAKUT-Patienten eine 2,93 Mb große Mikroduplikation im chromosomalen Band 1q21.1 identifiziert wurde, konnte das Spektrum der Symptome des bereits beschriebenen 1q21.1 Mikroduplikationssyndroms um einen renalen Phänotyp erweitert werden, der bisher in diesem Zusammenhang nicht beschrieben worden war

Caldendrin–Jacob: A Protein Liaison That Couples NMDA Receptor Signalling to the Nucleus

NMDA (N-methyl-D-aspartate) receptors and calcium can exert multiple and very divergent effects within neuronal cells, thereby impacting opposing occurrences such as synaptic plasticity and neuronal degeneration. The neuronal Ca2+ sensor Caldendrin is a postsynaptic density component with high similarity to calmodulin. Jacob, a recently identified Caldendrin binding partner, is a novel protein abundantly expressed in limbic brain and cerebral cortex. Strictly depending upon activation of NMDA-type glutamate receptors, Jacob is recruited to neuronal nuclei, resulting in a rapid stripping of synaptic contacts and in a drastically altered morphology of the dendritic tree. Jacob's nuclear trafficking from distal dendrites crucially requires the classical Importin pathway. Caldendrin binds to Jacob's nuclear localization signal in a Ca2+-dependent manner, thereby controlling Jacob's extranuclear localization by competing with the binding of Importin-α to Jacob's nuclear localization signal. This competition requires sustained synapto-dendritic Ca2+ levels, which presumably cannot be achieved by activation of extrasynaptic NMDA receptors, but are confined to Ca2+ microdomains such as postsynaptic spines. Extrasynaptic NMDA receptors, as opposed to their synaptic counterparts, trigger the cAMP response element-binding protein (CREB) shut-off pathway, and cell death. We found that nuclear knockdown of Jacob prevents CREB shut-off after extrasynaptic NMDA receptor activation, whereas its nuclear overexpression induces CREB shut-off without NMDA receptor stimulation. Importantly, nuclear knockdown of Jacob attenuates NMDA-induced loss of synaptic contacts, and neuronal degeneration. This defines a novel mechanism of synapse-to-nucleus communication via a synaptic Ca2+-sensor protein, which links the activity of NMDA receptors to nuclear signalling events involved in modelling synapto-dendritic input and NMDA receptor–induced cellular degeneration

Identification of a Novel Essential Two-Component Signal Transduction System, YhcSR, in Staphylococcus aureus

Two-component signal transduction systems play an important role in the ability of bacteria to adapt to various environments by sensing changes in their habitat and by altering gene expression. In this study, we report a novel two-component system, YhcSR, in Staphylococcus aureus which is required for bacterial growth in vitro. We found that the down-regulation of yhcSR expression by induced yhcS antisense RNA can inhibit and terminate bacterial growth. Moreover, without complementary yhcS or yhcR, no viable yhcS or yhcR gene replacement mutant was recoverable. Collectively, these results demonstrated that the YhcSR regulatory system is indispensable for S. aureus growth in culture. Moreover, induced yhcS antisense RNA selectively increased bacterial susceptibility to phosphomycin. These data suggest that YhcSR probably modulates the expression of genes critical for bacterial survival and may be a potential target for the development of novel antibacterial agents

Global Regulation of Gene Expression by ArlRS, a Two-Component Signal Transduction Regulatory System of Staphylococcus aureus

Staphylococcus aureus expresses various cell wall-associated and extracellular virulence factors, coordinately controlled by different two-component signal transduction systems and transcriptional regulators. In this study, we used microarray technology to identify the genes regulated by ArlR. The microarray data indicate that ArlR functions as a positive regulator and also as a negative repressor to directly and/or indirectly mediate the expression of at least 114 genes involved in different functions, including autolysis, cell division, growth, and pathogenesis

Indications for a dietary change in the extinct Bovid genus Myotragus (Plio-Holocene, Mallorca, Spain).

8 pagesInternational audienceEvolution in isolated island has shaped a variety of endemic taxa with outstanding characteristics. Amongst them is the extinct bovid genus Myotragus, endemic to Mallorca and Menorca Island, for which six succeeding species have been described: M. palomboi, M. pepgonellae, M. antiquus, M. kopperi, M. batei and M. balearicus. Myotragus has developed special cranial and post-cranial adaptations to meet the specific ecological demands of its insular habitat, like progressive dwarfing and fused limb elements. During its evolution, the dentition of Myotragus underwent subsequent changes: firstly a reduction in the number of teeth, and secondly an increase in hypsodonty. The ecological conditions inducing this dental evolution, especially Myotragus' diet, remain unknown. In this study, methods of 3D-dental topometry, enamel surface texture analysis according to ISO/FDIS 25178-2, and Scale-Sensitive Fractal Analysis (SSFA) are applied in order to infer palaeodiets of M. pepgonellae, M. kopperi, M. batei and M. balearicus, and to test the hypothesis that a dietary change may have occurred in the Myotragus lineage which relates to gradual morphological changes on upper second molars. We detect changes in the enamel/dentin ratio, enamel ridge length and enamel surface area within the lineage. Furthermore, Myotragus balearicus has enamel surface texture characteristics also present in extant browsing ungulates, while the three antecedent Myotragus species show an enamel surface texture signal similar to extant grazers. These results suggest a dietary change and are interpreted as a successive adaptation to limited resources in an isolated, insular environment. They can either be a consequence of a change in plant community structure or a successive expansion of Myotragus' dietary range due to increased intraspecific competition

Dietary divergence in space and time - Lessons from the dwarf-goat Myotragus balearicus (Pleisto-Holocene, Mallorca, Spain).

8 pagesInternational audienceNewly colonised, isolated habitats, like islands, provide diverse niches to be filled and are prone to facilitate ecological separation which might lead to an adaptive radiation. Examples of such radiations can be found in the Mediterranean for the genera Candiacervus (Crete), Nesogoral (Sardinia) and Hoplitomeryx (Gargano). A different strategy to cope with limited resources on islands is generalism. We test whether populations of the endemic bovid Myotragus balearicus from two sites and Pleistocene as well as Holocene levels on Mallorca island displays ecological separation indicated by diet, or whether the species shifted its dietary trait towards generalism. We expect to find either: (1) dietary divergence in space and time (between sites and stratigraphic levels), which would indicate niche partitioning and/or a shift in dietary traits due to environmental influences; or (2) dietary congruence in a less specialised, generalistic dietary strategy in space and time which would indicate a flexible trait to cope with instable resource availability. We compare individuals from a fossil assemblage at a northern site and one assemblage from the eastern coast in terms of their dietary traits. Traits are reconstructed using dental dietary proxies, complementary in time scale and resolution. (1) 3D-dental topometry and (2) enamel surface texture analysis. Data suggest that individuals from both assemblages of M. balearicus behaved as variable browse dominated intermediate feeders. We thus conclude that the observed variability relates to a shift towards generalism as a subsistence strategy. We consider hypsodonty the pre-adaptation for this life style that enabled M. balearicus to exploit almost any food source in its energetically restricted island habitat

Severe mental retardation with breathing abnormalities (Pitt−Hopkins syndrome) is caused by haploinsufficiency of the neuronal bHLH transcription factor TCF4

Pitt−Hopkins syndrome (PHS) is a rare syndromic mental disorder, which is mainly characterized by severe motor and mental retardation including absent language development, a characteristic facial gestalt and episodes of hyperventilation. We report on a female patient with PHS showing severe mental retardation with absent speech, pronounced muscular hypotonia, ataxia, distinctive facial features, such as a coarse face, a broad nasal bridge and a wide mouth, and hyperventilation attacks. In this patient, genomic profiling by array−based comparative genomic hybridization and fluorescence in situ hybridization studies detected and confirmed a de novo 0.5 Mb deletion in 18q21.2 containing a single gene, the basic helix−loop−helix transcription factor TCF4. cDNA and genomic analyses in the patient and her parents demonstrated TCF4 haploinsufficiency as the underlying cause of the disease. Analysis of the embryonal expression pattern of the Danio rerio ortholog, tcf4, by whole−mount in situ hybridization showed a highly specific expression domain in the pallium of the telencephalon during late somitogenesis, when the patterning of the zebrafish brain is advanced and neural differentiation commences. Later expression domains were restricted to several regions in the central nervous system, including continued expression in the pallium of the telencephalon, and starting expression in the diencephalon (thalamus, ventral thalamus and posterior tuberculum), the midbrain tegmentum, the hindbrain and the branchial arches. This expression pattern correlates with the clinical phenotype. Our results show that haploinsufficiency of TCF4 causes PHS and suggest that D. rerio is a valuable model to study the molecular pathogenesis of PHS and the role of TCF4 in brain developmen

Targeted therapy of advanced parathyroid carcinoma guided by genomic and transcriptomic profiling

Parathyroid carcinoma (PC) is an ultra‐rare malignancy with a high risk of recurrence after surgery. Tumour‐directed systemic treatments for PC are not established. We used whole‐genome and RNA sequencing in four patients with advanced PC to identify molecular alterations that could guide clinical management. In two cases, the genomic and transcriptomic profiles provided targets for experimental therapies that resulted in biochemical response and prolonged disease stabilization: (a) immune checkpoint inhibition with pembrolizumab based on high tumour mutational burden and a single‐base substitution signature associated with APOBEC (apolipoprotein B mRNA editing enzyme, catalytic polypeptide‐like) overactivation; (b) multi‐receptor tyrosine kinase inhibition with lenvatinib due to overexpression of FGFR1 (Fibroblast Growth Factor Receptor 1) and RET (Ret Proto‐Oncogene) and, (c) later in the course of the disease, PARP (Poly(ADP‐Ribose) Polymerase) inhibition with olaparib prompted by signs of defective homologous recombination DNA repair. In addition, our data provided new insights into the molecular landscape of PC with respect to the genome‐wide footprints of specific mutational processes and pathogenic germline alterations. These data underscore the potential of comprehensive molecular analyses to improve care for patients with ultra‐rare cancers based on insight into disease biology