Novel DNA microarray in sepsis diagnostics

Sepsis is defined as a documented infection with systemic inflammatory response syndrome (SIRS). When pathogens have been detected by blood culturing method, the condition is classified as a bloodstream infection (BSI). The frequency of severe sepsis is approximately 90.4 cases per 100 000 population in Europe and circa 751 000 cases annually in United States. Sepsis is associated with high mortality rates ranging up to 50 % in most severe cases. The presence of immunocompromising conditions, chronic diseases, prosthetic devices such as intravenous lines or urinary catheters and higher age are factors which typically increase the infection risk. Currently, common causative bacteria such as Staphylococcus aureus, other staphylococci, Escherichia coli and Klebsiella pneumoniae are detected using blood culturing method. It is time-consuming, especially in case of fastidious and slow growing bacteria and thus initial empirical therapy typically contains broad-spectrum antimicrobial(s). Rapid methods for sepsis/BSI diagnostics are needed to improve patient outcomes, decrease length of stay in hospital and related costs. When causative pathogens are identified earlier, also appropriate antimicrobials can be administered earlier. The aim of this study was to develop a polymerase chain reaction (PCR) and microarray-based assay for the detection of main causative pathogens and methicillin resistance marker from patients with suspected sepsis/BSI. The assay, which utilized the Prove-it TubeArray platform, was first developed for detection of 12 bacterial species, coagulase negative Staphylococcus group and methicillin resistance marker. The performance of this assay was evaluated with blood culture samples. The bacterial panel was further improved for the detection of over 50 causative pathogens in sepsis/BSI. This optimized assay was clinically validated with over 3300 blood culture samples collected from HUSLAB, Finland and UCLH, United Kingdom. The developed assay, named Prove-it Sepsis, demonstrated 94.7 % sensitivity and 98.8 % specificity. Based on this validation study, the assay was CE-marked for in vitro diagnostics in Europe. This diagnostics assay with the improved target panel was also successfully transferred and optimized to the Prove-it StripArray platform, whose capacity of 1-96 simultaneous analyses responds to the need of hospital laboratories dealing with larger sample amounts. Another aim of this study was to evaluate the PCR and microarray assay s suitability for identification of pathogens directly from whole blood samples without a culturing step. The assay was combined with a selective bacterial deoxyribonucleic acid (DNA) isolation method and the performance of this combination was evaluated with spiked blood samples. Detection limit of 11-600 colony forming units per mL was obtained depending on the target organism. In addition, analytical sensitivity of 1-21 genome equivalents for the PCR and microarray assay was demonstrated. These results showed proof-of-concept for the combination assay and feasibility of the PCR and microarray assay to be used for more sensitive applications after an extensive optimization phase. Molecular assays have opened a new era in microbiological laboratories and brought a broadened perspective parallel to the conventional culturing and phenotype-based method. Also in this study, genotype-based characterization was utilized to offer more accurate identification than conventional culturing. In future, understanding the clinical relevance of DNAemia/circulating DNA may open new strategies to the management of septic patients using nucleic acids-based assays.Sepsis tarkoittaa vakavaa yleisinfektiota ja tulehdusreaktio-oireyhtymää, johon liitetään usein veriviljelypositiivisuus. Yleisyys Euroopassa on 90.4 tapausta 100 000 ihmistä kohden ja Yhdysvalloissa noin 751 000 tapausta vuosittain. Sepsikseen liitetään korkea kuolleisuus, jopa 50 %. Heikentynyt immuunipuolustus, krooniset sairaudet sekä korkea ikä saattavat lisätä sairastumisriskiä. Yleisimpiä aiheuttajabakteereita ovat muun muassa Staphylococcus aureus ja muut stafylokokit, Escherichia coli ja Klebsiella pneumoniae. Resistentit ja multi-resistentit bakteerikannat ovat yleensä hoidollisesti vaikeimpia, koska tehokkaan mikrobilääkehoidon kohdistaminen saattaa olla vaikeaa. Tällä hetkellä sepsis osoitetaan veriviljelydiagnostiikan avulla, jolloin mikrobi pyritään tunnistamaan potilaan verestä. Viljely on hidas menetelmä vaativissa kasvuolosuhteissa kasvavien mikrobien kohdalla, siksi potilaan empiirinen ensihoito koostuu yleensä laajakirjoisesta mikrobilääkkeestä tai lääkeyhdistelmistä. Nopeutetun diagnostiikan avulla mikrobi(t) pystyttäisiin tunnistamaan nopeammin ja näin ollen kohdistettu lääkehoito aloittamaan aikaisemmin. Tämän työn tavoitteena oli kehittää PCR-monistus- ja mikrosirutekniikkaan perustuva testi sepsiksen aiheuttajamikrobien tunnistamiseen. Ensin kehitettiin tunnistus 12 bakteerilajille, koagulaasinegatiiviselle stafylokki-ryhmälle sekä metisilliiniresistenssi-geenimarkkerille positiivisesta veriviljelynäytteestä. Testialustaksi optimoitiin Prove-it TubeArray -mikrosiru, jolla pystyi analysoimaan 1-24 näytettä kerrallaan. Testin toimivuus arvioitiin kerätyillä veriviljelynäytteillä. Seuraavassa vaiheessa mikrobipaneeli laajennettiin kattamaan yli 50 sepsiksen aiheuttajamikrobia. Tämän parannetun testiversion toimivuus arvioitiin yli 3300 veriviljelynäytteen avulla, jotka oli kerätty HUSLAB:ssa Suomessa ja UCHL:ssä Isossa-Britaniassa. PCR- ja mikrosirutesti nimettiin Prove-it Sepsis -testiksi, jolle määritettiin 94.7 %:n herkkyys ja 98.8 %:n tarkkuus, kun testitulosta verrattiin veriviljelyn mikrobilöydöksiin. Tämän arvioinnin perusteella testi CE-merkittiin in vitro diagnostiikkaan Euroopassa. Kehitystä jatkettiin Prove-it TubeArray -testialustan lisäksi myös Prove-it StripArray -testialustalle, jolla saattoi analysoida 1-96 näytettä samanaikaisesti. Useamman näytteen yhtäaikainen analysointi vastaa paremmin tarvetta isoissa laboratorioissa, joissa näytekapasiteetti on suurempi. Lisäksi tutkittiin PCR- ja mikrosirutestin soveltuvuutta mikrobitunnistukseen suoraan potilaan verinäytteestä ilman rikastusvaihetta. Spesifinen bakteeri-DNA:n eristysmenetelmä potilasverinäytteestä yhdistettiin PCR- ja mikrosirutestin kanssa. Tätä yhdistelmää arvioitiin verinäytteillä, joihin oli lisätty tietty pitoisuus bakteereita. Analysoinnin tuloksena tämän yhdistelmätestin herkkyydeksi määritettiin bakteerilajista riippuen 11-600 pesäkettä muodostavaa yksikköä per mL. Lisäksi PCR- ja mikrosirutestin analyyttiseksi herkkyydeksi määritettiin 1-21 genomiekvivalenttia. Tulokset osoittivat, että PCR- ja mikrosirutesti saattaisi olla kehitettävissä myös herkempiin sovelluksiin kuin rikastettuun näytemateriaaliin, esimerkiksi muokkaamalla testiä yhdessä kuvatun DNA-eristysmenetelmän kanssa. Molekyylipohjaiset testit ovat jo avanneet uuden aikakauden mikrobiologisissa laboratorioissa. Mikrobien geenipohjainen luokittelu ja karakterisointi tarjoavat sellaisia mahdollisuuksia, joita fenotyyppipohjaisella luokittelulla ei pystytä välttämättä saavuttamaan. Näitä havaintoja tehtiin myös tässä tutkimuksessa, kun PCR- ja mikrosirutesti tunnisti bakteereja potilasnäytteistä, joissa viljely epäonnistui tai ei antanut oikeaa tulosta. Sepsispotilaan verenkierrosta löytyvän bakteeri-DNA:n kliininen merkittävyys infektioissa ei ole vielä täysin selvää. Sen ymmärtämisen myötä voidaan kehittää nopeampia nukleiinihappopohjaisia strategioita sepsispotilaan diagnosointiin

Evaluation of High-Throughput PCR and Microarray-Based Assay in Conjunction with Automated DNA Extraction Instruments for Diagnosis of Sepsis

BACKGROUND: High incidence of septic patients increases the pressure of faster and more reliable bacterial identification methods to adapt patient management towards focused and effective treatment options. The aim of this study was to assess two automated DNA extraction solutions with the PCR and microarray-based assay to enable rapid and reliable detection and speciation of causative agents in the diagnosis of sepsis. METHODOLOGY/PRINCIPAL FINDINGS: We evaluated two automated DNA instruments NucliSENS® easyMAG® and NorDiag Arrow for the preparation of blood culture samples. A set of 91 samples flagged as positive during incubation was analyzed prospectively with the high-throughput generation of Prove-it™ Sepsis assay designed to identify over 60 gram-negative and gram-positive bacterial species as well as methicillin resistance marker from a blood culture. Bacterial findings were accurately reported from 77 blood culture samples, whereas 14 samples were reported as negative, containing bacteria not belonging to the pathogen panel of the assay. No difference was observed between the performance of NorDiag Arrow or NucliSENS® easyMAG® with regard to the result reporting of Prove-it™ Sepsis. In addition, we also assessed the quality and quantity of DNA extracted from the clinical Escherichia coli isolate with DNA extraction instruments. We observed only minor differences between the two instruments. CONCLUSIONS: Use of automated and standardized sample preparation methods together with rapid, multiplex pathogen detection offers a strategy to speed up reliably the diagnostics of septic patients. Both tested DNA extraction devices were shown to be feasible for blood culture samples and the Prove-it™ Sepsis assay, providing an accurate identification of pathogen within 4.5 hours when the detected pathogen was in the repertoire of the test

Compromised Peak Bone Mass in Patients with Inflammatory Bowel Disease-A Prospective Study

Peer reviewe

Potential Diarrheal Pathogens Common Also in Healthy Children in Angola

Background: Globally, diarrhea kills almost 1500 children daily. In diagnostics, molecular methods are replacing traditional assays. We aimed to investigate enteropathogens in children with and without diarrhea in Luanda, the capital of Angola. Methods: One hundred and ninety-four stool samples from 98 children with acute diarrhea and 96 children without diarrhea were investigated for 17 enteropathogens with multiplex real-time polymerase chain reaction. Results: The median age of children was 10.5 months. Enteropathogens, bacteria, viruses and parasites were detected in 91%, 78%, 50% and 25%, respectively. A positive finding was significantly (P = 0.003) more common in diarrhea when testing for all pathogens combined, for bacteria alone and for viruses alone. More than one pathogen was found more frequently in diarrhea than in non-diarrhea stool samples, in 87% and in 59% (P <0.0001), respectively. The median number (interquartile range) of pathogens detected was 3 (2) versus 1.5 (2; P <0.0001), respectively. When age was taken into account, diarrhea was found to be associated with enterotoxigenic and enteroaggregative Escherichia coli, Shigella, Campylobacter, rotavirus, sapovirus and Cryptosporidium. Conclusions: Multiplex polymerase chain reaction detected enteropathogens in almost all stool samples of children in Luanda, albeit this occurred more often in diarrhea. Children with diarrhea showed more mixed infections than children without diarrhea.Peer reviewe

Nurmen täydennyskylvön vaikutus satoon aukkoisessa kasvustossa

Onnistuneella täydennyskylvöllä voidaan jatkaa nurmen ikää ja alentaa siten perustamiskustannuksia. Vaikutusten ja kannattavuuden kvantitatiivinen mittaaminen on kuitenkin haasteellista mm. lukuisten eri täydennyskylvötekniikoiden ja nurmien vaihtelevan tiheyden vuoksi. Aukkoisen nurmen täydennyskylvön onnistumista pidetään todennäköisempänä kuin tasaisesti harvan. Nurmet Rahaksi –hankkeessa tutkittiin kahdella kokeella nurmen täydennyskylvön vaikutusta sadon määrään ja sulavuuteen aukkoisuudeltaan erilaisissa timotei-nurminatanurmissa.Kokeet toteutettiin Luonnonvarakeskuksen Kuopion toimipaikassa Maaningalla vuosina 2015–2017. Koeasetelmana oli osaruutukoe viidellä toistolla. Pääruutuna oli nurmen aukkoisuus (täystiheä, 15% aukkoja, 28% aukkoja, 40% aukkoja) ja osaruutuna täydennyskylvö/ei täydennyskylvöä. Aukot tehtiin kasvustoon erikokoisia pyöreitä reikiä (halkaisija 20, 30 ja 40 cm) sisältävän muovisapluunan sekä glyfosaatin avulla. Täydennyskylvöt (tim-nn-seos, 12 kg ha-1) tehtiin koeruutukylvökoneella käyttäen vantaita. Ensimmäisessä kokeessa (Koe 1) nurmi perustettiin suojaviljaan keväällä 2013, kasvusto aukotettiin syksyllä 2014 ja täydennyskylvö tehtiin keväisin 2015, 2016 ja 2017. Toisen kokeen (Koe 2) nurmi perustettiin suojaviljaan keväällä 2014, aukotettiin syksyllä 2015 ja täydennyskylvettiin vain kerran keväällä 2016. Sato korjattiin kaksi kertaa vuonna 2015 ja kolme kertaa vuosina 2016 ja 2017. Kokeilta määritettiin ruuduittain sadon kuivapaino sekä rehuarvot. Lisäksi havainnoitiin täydennyskylvön orastumista silmämääräisesti.Keväällä 2015 täydennyskylvö ei onnistunut kunnolla. Ensimmäisessä sadossa täydennyskylvö alensisatoa 260 kg ka ha-1, mikä johtui todennäköisesti vantaiden aiheuttamista vaurioista. Toisessa sadossa satoeroa ei ollut. Keväällä 2016 täydennyskylvö tehtiin molemmille kokeille ja se onnistui hyvin etenkin kokeella 2. Kokeessa 1 täydennyskylvö laski ensimmäistä satoa 130 kg ka ha-1, mutta nosti toista satoa120 kg ka ha-1. Kokeessa 2 täydennyskylvö nosti toista satoa 110 kg ka ha-1. Keväällä 2016 tehdyn täydennyskylvön vaikutus oli kokeella 2 silmämääräisesti havaittavissa nurmen tiheydessä. Vuonna2017 täydennyskylvö nosti ensimmäistä satoa kokeella 2 keskimäärin 340 kg ka ha-1 ja 760 kg ka ha-1, kun aukkoja oli 40%. Toisessa sadossa sadon määrä nousi 280 kg ka ha-1, kun aukkoja oli 40%, mutta laski 210 kg ka ha-1 aukottomalla koejäsenellä. Kokeella 1 vaikutus näkyi lähes merkitsevästi vain toisessa sadossa.Aukkoisuus laski selvästi sadon määrää aukottamista seuraavassa sadossa, mutta vaikutus oli odotettua pienempi myöhemmissä sadoissa. Nurmi kompensoi aukkoisuutta aukkojen laitojen korkeammalla ja rotevammalla kasvustolla. Ilmiötä ei voine yleistää suurempiin aukkoihin. Aukot täyttyivät rikkakasveilla ja aiheuttivat kasvinsuojeluruiskutuksen tarpeen. Täydennyskylvön yksi etu onkin rikkakasvipaineen vähentäminen.Kokeissa havaittu täydennyskylvön vaikutus sadon määrään sekä sulavuuteen oli vähäinen myös silloin, kun nurmi oli hyvin aukkoinen ja täydennyskylvö onnistui

Susac syndrome: inflammatory disease of retina, inner ear and small arterias of central nervous system

Vertaisarvioitu.Susacin oireyhtymä on harvinainen endoteelin tulehdussairaus, joka ilmenee erityisesti kolmessa sijainnissa: verkkokalvon, sisäkorvan ja aivojen pikkuvaltimoissa. Sen ajatellaan olevan autoimmuunisairaus, jossa epätarkoituksenmukainen tulehdusreaktio kohdistuu pienten valtimoiden endoteeliin, aiheuttaa verenkiertohäiriöitä ja eksudaattia valtimon ympärille sekä siten kohde-elimen toimintahäiriöitä (näkökenttäpuutokset ja valonvälähdykset, kuulon heikkeneminen). Diagnoosi perustuu keskeisesti verkkokalvon kuvantamislöydöksiin. Lisätukea diagnoosille voidaan saada aivojen magneettikuvauksesta ja mahdollisen sisäkorvaperäisen kuulon heikkenemisen osoittamisesta. Näyttöön perustuvia hoitosuosituksia ei ole, mutta immuunijärjestelmää hillitsevällä ja antitromboottisella lääkityksellä voidaan vaikuttaa taudinkulkuun. Hoitoa tulisi tehostaa nopeasti, mikäli runsaita aivomuutoksia ilmenee.Peer reviewe

Neurofilament light level correlates with brain atrophy, and cognitive and motor performance

Peer reviewe

Ympäristöllisten lupamenettelyjen yhden luukun lainsäädäntöhankkeen vaikutusten arviointi

Selvityksessä on arvioitu ympäristöministeriössä valmisteltavaa lainsäädäntöehdotusta ympäristöllisten lupamenettelyjen ajalliseksi yhteensovittamiseksi (ns. yhden luukun menettely). Uudistus koskisi eniten ympäristö- ja vesilupia, ympäristövaikutusten arviointia, rakennuslupaa ja kemikaaliturvallisuuslupaa. Arvioinnin perusteella investointien nopeutumisesta ja yritysten hallinnollisten kustannusten vähentymisestä johtuvat taloudelliset hyödyt jäävät vuositasolla vähäisiksi. Taloudellisten vaikutusten suuruus ja suunta riippuvat kahdesta epävarmasta tekijästä: siitä, kuinka paljon lupien käsittelyajat todellisuudessa lyhenevät sekä siitä, kuinka paljon monilupaisia hankkeita lopulta käsitellään yhdessä luukussa. Ilmeistä kuitenkin on, että lupamenettelyjen pidemmälle viety integrointi vahvistaisi vaikutuksia eli lisäisi etenkin investointien nopeutumisesta saatavia hyötyjä. Lupamenettelyjen ajallinen yhteensovittaminen vaatii toimiakseen koordinoivan viranomaisen. . Yhden luukun lupapalveluiden onnistumisen kannalta olennaista on myös sähköisen palveluympäristön toimivuus. Lainsäädäntöhankkeella ei arvioida olevan merkittäviä ympäristövaikutuksia. Kansalaisten osallistumismahdollisuuksien kannalta ajallinen yhteensovittaminen voi olla ongelmallinen, koska kansalaisten ja järjestöjen voi olla vaikea saavuttaa riittävä ymmärrys monilupaisesta hankkeesta ja valmistella sitä koskeva muistutus tai mielipide laajasta kuulemisaineistosta lyhyen kuulemisajan puitteissa. Selvityksessä on arvioitu myös YVA- ja lupamenettelyjen yhteensovittamista erityisesti tarkastelemalla ympäristövaikutusten arviointiselostuksen ja lupahakemuksen kuulemisen yhdistämistä, josta voi seurata enimmillään 3 kuukauden aikasääst