El sistema de fosforilación oxidativa en la adipogénesis: Efecto de xenobióticos

Además de los 23 pares de cromosomas localizados en el núcleo (nDNA), el genoma humano incluye una multitud de moléculas de DNA localizadas en las mitocondrias, el DNA mitocondrial (mtDNA). El mtDNA codifica 13 subunidades muy importantes del sistema de fosforilación oxidativa (OXPHOS) y los RNAs necesarios para su expresión. Este ruta bioquímica no solo es la principal vía productora de energía de las células, también media la interacción con el ambiente. Por su localización y particularidades genéticas, el mtDNA acumula mutaciones mucho más rápidamente que el nDNA, y algunas de estas mutaciones pueden dar lugar a fenotipos de enfermedad muy graves. Aunque se sabe algo sobre los mecanismos fisiopatológicos de estas mutaciones en las células diferenciadas, se desconoce casi totalmente sus efectos sobre la capacidad de autorrenovación y el potencial de diferenciación de las células madre, necesarias para mantener la dinámica tisular. Por otro lado, el tejido adiposo en mamíferos está compuesto por el tejido adiposo marrón (BAT) y el tejido adiposo blanco (WAT). Su principal función es la de almacenar y liberar triglicéridos, pero tiene además una importante función endocrina, contribuyendo a la regulación de la homeostasis energética. Los adipocitos, y en general el tejido adiposo, son los principales protagonistas tanto en la obesidad como en una serie de enfermedades emergentes asociadas, como la diabetes tipo II, enfermedades cardiovasculares, hipertensión, dislipidemias e incluso algunos tipos de cáncer. Aunque la principal función de la mitocondria sea su participación en el metabolismo energético, recientemente se ha incrementado el número de datos que demuestran el papel de este orgánulo en los procesos de diferenciación celular. Se han publicado algunos resultados que muestran que la maduración de los adipocitos está acompañada de una biogénesis mitocondrial y de un incremento en el metabolismo oxidativo. La adaptación del fenotipo mitocondrial durante la diferenciación se refleja en cambios en la distribución de la red mitocondrial así como en alteraciones en la expresión génica y en la organización del sistema OXPHOS. Existen muchos xenobióticos ampliamente utilizados en medicina, como son los antibióticos ribosomales o los dideoxinucleótidos (inhibidores de polimerasas mitocondriales), cuyos efectos sobre la dinámica celular no han sido bien estudiados. Lo mismo ocurre con otros compuestos frecuentemente utilizados en diferentes actividades humanas (pesticidas, industria alimentaria, etc.). Así, nuestra hipótesis es que dado que estos xenobióticos afectan a la expresión y función del sistema OXPHOS, éstos pueden afectar también a los procesos de autorrenovación y diferenciación adipogénica de las células madre adultas. Como conclusiones más importantes extraídas del desarrollo de esta tesis doctoral se ha visto que la diferenciación adipogénica de células madre derivadas de tejido adiposo (hASC) va acompañada de un proceso de biogénesis mitocondrial, que los antibióticos que se utilizan habitualmente en los laboratorios de cultivo celular afectan a la diferenciación de las hASC a adipocitos, que un tóxico ambiental, cloruro de tributiltina (TBTC), estimula la adipogénesis de las hASC de forma similar a un inhibidor de la ATP sintasa (CV), oligomicina, lo que apoya la hipótesis de que dicho complejo sea la diana del TBTC para sus efectos como obesógeno, que el antibiótico ribosomal linezolid, como inhibidor de la traducción mitocondrial, disminuye la capacidad de diferenciación adipogénica de las hASC y que además provoca cambios en el perfil secretómico de las hASC diferenciadas a adipocito. Concretamente, causa un aumento en la expresión de fibronectina e inhibe la de la apolipoproteína E (ApoE). Además, el linezolid disminuye el estado de metilación global del genoma, por lo que estos cambios epigenéticos pueden ser una de las causas de las alteraciones observadas

Creación y caracterización de un cíbrido transmitocondrial portador de una nueva mutación con fenotipo mitocondrial.

La mitocondria es el orgánulo encargado de generar energía (ATP) en la célula. Cuenta con su propio sistema genético independiente que codifica, entre otros, proteínas del sistema OXPHOS. Las enfermedades mitocondriales se producen por defectos en dichas proteínas. Estos defectos pueden deberse a mutaciones en el DNA nuclear o en el mtDNA. Las patologías mitocondriales presentan una clínica muy heterogénea y su diagnóstico es complicado. Se agrupan en síndromes (Síndrome de MELAS, MERRF, NARP) y las mutaciones generalmente presentes están bien descritas.El estudio de las patologías mitocondriales se produce en líneas celulares cíbridas al ser un buen modelo de estudio que permite unificar el DNA nuclear en todos los cíbridos producidos.En este trabajo, se crea un cíbrido transmitocondrial con plaquetas del paciente 3548 que muestra un fenotipo mitocondrial posiblemente asociado a la mutación m.11232T>C que afecta a la subunidad 4 del complejo I de la cadena respiratoria. Esta mutación ha sido descrita con anterioridad en una ocasión.Como parte de la caracterización del cíbrido 3548 portador de la mutación de estudio, se realizan estudios de la curva de crecimiento, de los niveles de síntesis de ATP, de especies reactivas de oxígeno (ROS) y del potencial de membrana mitocondrial (MMP). Debido a que la mutación afecta a una subunidad del complejo I, se pretende analizar la actividad de este a través de dos técnicas; BN-PAGE en combinación con detección catalítica y medida de la actividad enzimática por espectrofotometría (puesta a punto de la técnica).El cíbrido 3548 sigue el mismo patrón de crecimiento que los cíbridos control y no se encuentran diferencias significativas (p-valor<br /

Caracterización del daño muscular y hepático causado por la exposición a un tóxico mitocondrial

El Tributyltin Chloride (TBTC) se trata de un xenobiótico declarado como tóxico que ha sido detectado a altas concentraciones en el medio marino. Esto ha provocado su presencia en determinados alimentos y en el agua de consumo diario, llegando a encontrarse a concentraciones entre 50 y 400 nM en muestras de sangre humanas. Diferentes estudios han declarado que este compuesto provoca el desarrollo de obesidad y diferentes síndromes metabólicos en mamíferos, además de resultar en otro tipo de afecciones como anormalidades a nivel de sistema endocrino, inmunotoxicidad o neurotoxicidad. En el presente trabajo analizamos el efecto provocado por el tóxico en ratones hembra gestantes y sus crías (únicamente hembras) tras la aplicación del TBTC a concentraciones entre 100 y 1000 nM por vía oral en los periodos de lactancia y gestación. Concretamente, se llevó a cabo un análisis de la grasa abdominal y el tejido hepático y muscular de las muestras recogidas. Los resultados muestran que la exposición directa a TBTC en ratones hembras gestantes ha provocado una acumulación lipídica en tejido hepático a concentraciones de 500 y 1000 nM del tóxico. Tras la exposición in utero al TBTC únicamente se ha observado un aumento del contenido en peso y de triglicéridos del tejido muscular, pudiendo desembocar en el desarrollo de resistencia a la insulina y diabetes.<br /

Creación y caracterización de un cíbrido transmitocondrial portador de una nueva mutación con fenotipo de LHON

La Neuropatía Óptica Hereditaria de Leber (LHON) es una enfermedad rara, caracterizada por ceguera, desmielinización axonal y pérdida de células ganglionares de la retina, consecuencia, entre otros factores, de mutaciones a nivel del mtDNA. No obstante, a pesar de la gran cantidad de avances recientes en esa área de estudio, a día de hoy, se trata de una patología cuyos mecanismos todavía no están dilucidados por completo, y por consiguiente, que carece de tratamiento eficaz, debido, principalmente, a la carencia de modelos adecuados para su estudio. Una posibilidad que permite superar dichas limitaciones es el desarrollo de cíbridos transmitocondriales, metodología que se decidió seguir en este trabajo mediante la fusión de células ρ0 143B y plaquetas de una paciente con aparente fenotipo de LHON con el objetivo de estudiar el defecto molecular provocado por la mutación m.15950G>A del mtDNA, afectando a nivel del tRNAThr, que únicamente había sido descrita con anterioridad en una ocasión, en un caso clínico completamente diferente al actual. Se llevaron a cabo estudios comparativos respecto a un cíbrido control que permitieron confirmar el carácter patogénico de la mutación puntual bajo estudio tras la observación, entre otros aspectos, de una menor expresión y actividad COX en los cíbridos mutantes que conducía a una inferior tasa de síntesis de ATP con posibles consecuencias negativas sobre la viabilidad celular del tejido afectado. Por tanto, estos estudios representan una primera comparación de los defectos en el sistema OXPHOS provocados en presencia de la mutación m.15950G>A, permitiendo una aproximación en el conocimiento del mecanismo fisiopatológico subyacente a la enfermedad.<br /

Enfermedades mitocondriales: mutaciones en el gen COX15

La mitocondria es un orgánulo esencial en el mantenimiento de las células eucariotas, su principal función es la producción de energía mediante el transporte de electrones en la cadena respiratoria de su membrana interna. Cuenta con cinco complejos, siendo el cuarto el complejo COX, encargado de llevar los electrones hasta el oxígeno para dar agua. Para la biosíntesis de la mitocondria es necesaria la colaboración de ADN mitocondrial y nuclear, y por tanto las enfermedades mitocondriales pueden estar causadas por mutaciones en ambos sistemas genéticos y dar síntomas muy variados en los pacientes. Para el desarrollo de este trabajo se han estudiado las mutaciones en el gen COX15, gen perteneciente al grupo COX y codificado por ADN nuclear. Cinco casos se han publicado al respecto, y en este trabajo se presenta un sexto caso que fue estudiado en el Departamento de Bioquímica de la Universidad de Zaragoza. Estos pacientes tienen en común la forma de presentación de su patología, siendo características la acidosis láctica y la hipotonía axial (a excepción de un caso que mantiene niveles normales), pero difieren en la forma de evolución, la edad de supervivencia y en las localizaciones de las mutaciones dentro del gen COX15. Cuatro de los seis casos han sido diagnosticados de Síndrome de Leigh. Se ha logrado concluir que existe una relación muy estrecha entre los distintos tipos de mutaciones en el gen COX15, su diferente grado de gravedad y el fenotipo clínico que producen. Se trata de un tema de plena actualidad ya que los mecanismos fisiopatológicos continúan siendo desconocidos para los investigadores, por ello el papel de los médicos es ofrecer un tratamiento sintomático y acompañar a estos pacientes durante su proceso de enfermedad. Se quiere resaltar la importancia de este tipo de enfermedades que por lo general resultan mortales a una temprana edad, y que de forma separada cuentan con pocos casos, pero conjuntamente suponen un problema social importante. Es necesario seguir investigando al respecto para lograr tratamientos eficaces y dirigidos

Xenobiotics that affect oxidative phosphorylation alter differentiation of human adipose-derived stem cells at concentrations that are found in human blood

Adipogenesis is accompanied by differentiation of adipose tissuederived stem cells to adipocytes. As part of this differentiation, biogenesis of the oxidative phosphorylation system occurs. Many chemical compounds used in medicine, agriculture or other human activities affect oxidative phosphorylation function. Therefore, these xenobiotics could alter adipogenesis. We have analyzed the effects on adipocyte differentiation of some xenobiotics that act on the oxidative phosphorylation system. The tested concentrations have been previously reported in human blood. Our results show that pharmaceutical drugs that decrease mitochondrial DNA replication, such as nucleoside reverse transcriptase inhibitors, or inhibitors of mitochondrial protein synthesis, such as ribosomal antibiotics, diminish adipocyte differentiation and leptin secretion. By contrast, the environmental chemical pollutant tributyltin chloride, which inhibits the ATP synthase of the oxidative phosphorylation system, can promote adipocyte differentiation and leptin secretion, leading to obesity and metabolic syndrome as postulated by the obesogen hypothesis

Síndrome MELAS: relación entre el porcentaje de ADN mitocondrial mutado y fenotipo

Las enfermedades mitocondriales son patologías causadas por mutaciones producidas en la cadena respiratoria, la cual se encuentra situada en la mitocondria. Esto se traduce en un déficit en la síntesis de energía en forma de ATP y, por tanto, en enfermedades de carácter multisistémico pudiendo aparecer desde la infancia hasta la edad adulta, en una población aparentemente sana. Este trabajo se ha centrado en el síndrome MELAS (miopatía mitocondrial, acidosis láctica y episodios similares a apoplejía), la cual es la patología más frecuente dentro de estas “enfermedades raras”. Este síndrome está causado en un 80% de los casos por una transición de los nucleótidos A a G producida por una mutación puntual en la posición 3243 del DNA mitocondrial que codifica el gen tRNA de Leucina. Clínicamente se caracteriza por manifestaciones neurológicas incluyendo convulsiones, encefalopatía y episodios similares a apoplejía además de otras manifestaciones secundarias también frecuentes, como baja talla, migraña, sordera, diabetes, intolerancia al ejercicio o patología psiquiátrica. Debido a la heterogeneidad que muestra este síndrome, se ha explicado las características genéticas presentes en las mitocondrias, teniendo en cuenta el tipo de herencia y los conceptos de poliplasmia, segregación mitótica, heteroplasmia y efecto umbral para así poder entender de forma más precisa el porqué de los patrones tan complicados que sigue esta enfermedad. Se han estudiado 8 familias recogiendo los síntomas o ausencia de ellos que presentan sus miembros. Con ello, se ha querido buscar una relación entre el fenotipo patológico de estos pacientes y la existencia de mayor gravedad en sus síntomas relacionado con el porcentaje de DNA mitocondrial mutado

Diagnóstico de enfermedades mitocondriales: Nuevas mutaciones del mtDNA y su caracterización patológica

Las enfermedades mitocondriales son un grupo de patologías generadas por mutaciones en la cadena de transporte mitocondrial que dan lugar a un déficit en la síntesis de energía en forma de ATP. Una de estas alteraciones es la deficiencia del complejo IV mitocondrial o citocromo C oxidasa, que afecta a diversas partes del organismo incluyendo corazón, músculo esquelético o hígado. La paciente estudiada en este trabajo presentaba una nueva mutación (m.7637A>G) en el gen MT-CO2 del mtDNA que codificaba una proteína COX2 disfuncional, lo que daba lugar a una deficiencia del complejo IV del sistema OXPHOS. Para establecer por completo la patogenicidad de la mutación se construyeron cíbridos transmitocondriales fusionando plaquetas de la paciente citada con la línea celular ρ0A549. Utilizando las células generadas y disminuyendo el número de copias del mtDNA mutante por medio de un tratamiento con bromuro de etidio, se analizaron parámetros mitocondriales como el nivel de heteroplasmia y de mtDNA, la actividad y cantidad de complejo IV y el funcionamiento del sistema OXPHOS para caracterizar patológicamente la nueva mutación. A la vista de los resultados, la mutación m.7637A>G puede ser de gran severidad por el mal funcionamiento del complejo IV de la cadena respiratoria mitocondrial

EFECTO DE XENOBIÓTICOS MITOCONDRIALES EN LA DIFERENCIACIÓN NEURONAL: IMPLICACIÓN EN LAS ENFERMEDADES MITOCONDRIALES Y NEURODEGENERATIVAS

En la actualidad, a pesar de muchos años de investigación, la mayoría de los mecanismos biológicos que dan lugar al desarrollo de enfermedades neurodegenerativas son todavía una incógnita. Se ha comprobado que son enfermedades muy ligadas al envejecimiento y, además, es posible que ciertos factores ambientales induzcan o provoquen estas patologías. Esto ocurre con el cloruro de tributilestaño, el cual se une a una subunidad del complejo V provocando su inhibición y a consecuencia, una disminución en la producción de ATP mitocondrial. Este tóxico ambiental se empleó como antiincrustante en la pintura que recubría los barcos y tiende a bioacumularse en especies tróficas superiores de la cadena alimentaria. De hecho, se han encontrado concentraciones de TBT y alguno de sus derivados en sangre humana, en un rango de 8-293 nM. Sin embargo, no se ha demostrado el efecto que pueden tener estos tóxicos en la diferenciación y funcionalidad neuronal.Por tanto, en el siguiente trabajo se han llevado a cabo estudios para ver cómo afectan diferentes concentraciones de TBTC en el desarrollo neuronal usando dos líneas celulares. Los ensayos con células SH-SY5Y no tuvieron resultados muy esclarecedores sobre la posible influencia del tóxico en el desarrollo neuronal, por lo que se empleó células madre neurales que proporcionan un modelo más real. Pequeños indicios muestran que patologías mitocondriales inducidas por factores ambientales pueden ser posibles.<br /

Is population frequency a useful criterion to assign pathogenicity to newly described mitochondrial DNA variants?

Population frequency has been one of the most widely used criteria to help assign pathogenicity to newly described mitochondrial DNA variants. However, after sequencing this molecule in thousands of healthy individuals, it has been observed that a very large number of genetic variants have a very low population frequency, which has raised doubts about the utility of this criterion. By analyzing the genetic variation of mitochondrial DNA-encoded genes for oxidative phosphorylation subunits in 195,983 individuals from HelixMTdb that were not sequenced based on any medical phenotype, we show that rare variants are deleterious and, along with other criteria, population frequency is still a useful criterion to assign pathogenicity to newly described variants