Investigation of the anti-inflammatory properties of 17-beta estradiol through the development of nanomaterials for cardiovascular drug delivery and diagnostic applications

Atherosclerosis is a chronic disease characterized by lipid plaque accumulation in arterial blood vessels, which leads to luminal reduction. Over time, this condition can restrict vital blood flow causing chronic conditions, such as angina, as well as acute coronary events, such as myocardial infarction. Although therapies aimed at treating conditions of atherosclerosis, such as hyperlipidemia and hypertension, can successfully mitigate clinical symptoms, preventing atheroma development early on is critical to long-term success. Accordingly, recent research demonstrating the critical role of the inflammatory response during initiation of the disease has spurred the development of treatments and techniques aimed to identify and treat areas of inflammation, with the ultimate goal of attenuating atherogenesis. 17Beta-Estradiol (E2) is a sex steroid that has been shown to have such anti-inflammatory effects on the vascular system. However, conventional pharmaceutical treatments of hydrophobic active agents, such as E2, typically cannot be administered locally due to insufficient uptake at sites of delivery. Therefore, the main objective of this thesis was to develop a nanoliposome delivery system for E2 with the aim of treating atherosclerotic inflammation. To this end, a liposomal delivery system composed of 1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (DOPC), cholesterol, and a cationic charging agent, dimethyldioctadecyl-ammonium (DDAB), was developed. The optimized vector was capable of an E2 encapsulation efficiency of 51.2 +/- 3.6% and loading capacity of 7.3 +/- 0.5 μg/mg, while cellular uptake in human coronary artery endothelial (HCAE) cells was demonstrated using florescence spectroscopy and confocal microscopy. E2-loaded liposomes were shown to reduce the expression of vascular cell adhesion molecule-1 (VCAM-1), an inflammatory cell biomarker, in response to the proinflammatory agent, C-reactive protein (CRP) in HCAE cells. Similarly, pretreatment with E2-loaded liposomes reduced the secretion of interleukin-8 (IL-8) and tumor necrosis factor alpha (TNF-α) by 60% and 68%, respectively, demonstrating the potential for this therapy to be used to address atherosclerotic-based inflammation. Within the framework of treating cardiovascular inflammation, the localization and detection of early stages of atherosclerotic plaque formation is crucial to successful diagnosis and, consequently, the appropriate application of therapeutic drug delivery vehicles. Accordingly, the second major objective of this work was to develop a surface-enhanced Raman scattering (SERS) nanoprobe for the detection of vascular inflammation in vitro. The SERS nanoprobe was fabricated by microwave technology and composed of a gold core, coated with the Raman reporter 4-mercaptobenzoic acid (4-MBA), and poly(allylamine hydrochloride) (PAH). To detect the upregulation of VCAM-1 in HCAE cells, the nanoprobe was biofunctionalized with the target antibody (anti-VCAM-1). Results demonstrated that SERS nanoprobes could successfully be used to detect and localize VCAM-1 expression in vitro via confocal Raman microscopy. Overall, this dissertation serves as an important step towards both delivering E2-loaded liposomes with the aim of attenuating the inflammatory response during the initiation of atherosclerosis, in tandem with a novel approach to detect and visualize areas of inflammation in vitro.L'athérosclérose est une maladie chronique caractérisée par l'accumulation d'une plaque lipidique dans les vaisseaux sanguins artériels résultant une réduction luminal. Au cours des années, cette condition peut restreindre le flux vital de sang et provoque des maladies chroniques, comme l'angine, ou bien des évènements coronariens sérieux, tels que l'infarctus du myocarde. Même si les thérapies pour traiter certaines conditions d'athérosclérose, comme l'hyperlipidémie et l'hypertension, peuvent atténuer les symptômes cliniques, la prévention du développement de l'athérome est essentielle au succès à long terme de ces thérapies. Par conséquent, des recherches récentes démontrant le rôle critique de la réponse inflammatoire lors de l'initiation de l'athérosclérose ont conduit à développer des traitements qui peuvent réduire l'inflammation, et de ce fait, l'athérogenèse. 17Beta-Estradiol (E2) est un stéroïde qui a des effets anti-inflammatoires sur le système vasculaire. Cependant, étant an agent hydrophobe, E2 ne peut généralement pas être administré localement en raison d'une mauvaise absorption des sites de livraison. C'est dans ce contexte que cette thèse vise à développer tout d'abord un véhicule d'un agent anti-inflammatoire (E2) dans le but de traiter une inflammation athéroscléreuse. Ce système était composé de 1,2-dioléoyl-sn-glycéro-3-phosphocholine (DOPC), cholestérol et d'un agent cationique, diméthyldioctadécyl-ammonium (DDAB) pour former des nanoliposomes. Une fois optimisés, les nanoliposomes étaient en mesure d'encapsuler 51,2 +/- 3,6 % de l'E2, avec une capacité de 7,3 +/- 0,5 μg/mg. L'internalisation cellulaire a été évaluée en utilisant des cellules de l'artère coronarienne humaine via la spectroscopie de fluorescence et microscopie confocale. Les liposomes encapsulant E2 ont réduit l'expression du molécule adhésion de cellulaire vasculaire-1 (VCAM-1), un biomarqueur de cellules inflammatoires, en réponse à l'agent pro-inflammatoire, protéine C-réactive (CRP) dans les cellules de l'artère coronarienne humaine. De plus, prétraitement avec les liposomes-E2 a réduit la sécrétion de l'interleukine-8 (IL-8) et facteur de nécrose tumorale alpha (TNF-α) de 60% et 68%, respectivement, ce qui démontre le potentiel de cette thérapie pour traiter l'inflammation à base d'athérosclérose.Afin de diagnostiquer et utiliser des agents thérapeutiques, il est également nécessaire de localiser et détecter les plaques athérosclérotiques. C'est ainsi que le deuxième objectif majeur de cette thèse s'inscrit dans le cadre de développement des nanoprobes pour détecter l'inflammation vasculaire in vitro à l'aide de la spectroscopie Raman exaltée par effet de surface (SERS). Ces nanoprobes, fabriquées par la technologie de microonde, sont composées d'un noyau d'or, enrobées du rapporteur Raman 4-mercaptobenzoïque acide (4-MBA), et poly(allylamine hydrochloride) (PAH). Pour détecter l'expression des molécules de l'adhésion des cellules vasculaires (VCAM-1) dans les cellules de l'artère coronarienne humaine, les nanoprobes ont été biofonctionnalisées avec l'anticorps de VCAM-1 (anti-VCAM-1). Les résultats ont démontré que les nanoprobes peuvent être utilisées pour détecter et localiser l'expression de VCAM-1 in vitro par la spectroscopie Raman et la microscopie confocale. Les résultats de cette thèse constituent donc un pas important vers le développement d'un véhicule d'agents anti-inflammatoires afin d'adresser la réponse inflammatoire impliquée dans l'initiation de l'athérosclérose. Ceci accompagné de la méthode d'imagerie proposée offrirait un outil robuste pour la détection des zones inflammatoires in vitro

Introducing Mammalian Cell Culture and Cell Viability Techniques in the Undergraduate Biology Laboratory

Undergraduate students learn about mammalian cell culture applications in introductory biology courses. However, laboratory modules are rarely designed to provide hands-on experience with mammalian cells or teach cell culture techniques, such as trypsinization and cell counting. Students are more likely to learn about cell culture using bacteria or yeast, as they are typically easier to grow, culture, and manipulate given the equipment, tools, and environment of most undergraduate biology laboratories. In contrast, the utilization of mammalian cells requires a dedicated biological safety cabinet and rigorous antiseptic techniques. For this reason, we have devised a laboratory module and method herein that familiarizes students with common cell culture procedures, without the use of a sterile hood or large cell culture facility. Students design and perform a time-efficient inquiry-based cell viability experiment using HeLa cells and tools that are readily available in an undergraduate biology laboratory. Students will become familiar with common techniques such as trypsinizing cells, cell counting with a hemocytometer, performing serial dilutions, and determining cell viability using trypan blue dye. Additionally, students will work with graphing software to analyze their data and think critically about the mechanism of death on a cellular level. Two different adaptations of this inquiry-based lab are presented—one for non-biology majors and one for biology majors. Overall, these laboratories aim to expose students to mammalian cell culture and basic techniques and help them to conceptualize their application in scientific research.