Neuroprotektion und Aktivierung von Neurotrophin-Signaltransduktionswegen durch Hemmung von Protein-Tyrosin-Phosphatasen und durch NO-Donatoren

Trotz des enormen Fortschrittes der Medizin und neuen Erkenntnissen über die pathologischen Mechanismen des neuronalen Zelltodes steht bislang keine wirkungsvolle, kausale Therapie zur Behandlung neurodegenerativer Erkrankungen zur Verfügung. Obwohl unterschiedliche Ursachen für den neuronalen Zelluntergang verantwortlich sein können, gibt es zunehmend Hinweise dafür, dass apoptotische Prozesse am Zelltod der neurodegenerativen Erkrankungen beteiligt sind. Eine Möglichkeit, die neuronale Apoptose im Verlauf neurodegenerativer Erkrankungen zu blockieren, stellt die Behandlung mit neurotrophen Wachstumsfaktoren dar. Durch Aktivierung verschiedenster Rezeptoren und Signaltransduktionskaskaden werden Schlüsselproteine aktiviert, die für die Hemmung der neuronalen Apoptose und somit für das neuronale Überleben notwendig sind. Aufgrund der molekularen Struktur der Wachstumsfaktoren ergeben sich aber insbesondere bei der Applikation Probleme, da diese Proteine die Blut-Hirn-Schranke nicht überwinden können. Eine mögliche Lösung dieses Problems besteht darin, die Wachstumsfaktor-induzierte, neuroprotektive Wirkung mittels Hemmung der Protein-Tyrosin-Phosphatasen zu imitieren. Anhand von quantitativen Untersuchungen konnten neuroprotektive Effekte für den Protein-Tyrosin-Phosphatase(PTP)-Inhibitor Orthovanadat festgestellt werden. Als zugrunde liegender Mechanismus wurde eine Phosphorylierung des hochaffinen NGF-Rezeptors TrkA nach Behandlung embryonaler, hippokampaler Neurone mit dem PTP-Inhibitor nachgewiesen. Sowohl die Phosphorylierung und Aktivierung von TrkA, als auch die Neuroprotektion waren dabei unabhängig von der Anwesenheit von NGF. Die NGF-vermittelte Neuroprotektion wird nach Aktivierung und Phosphorylierung des TrkA-Rezeptors überwiegend mittels Aktivierung zweier Signaltransduktionswege vermittelt: mittels des PI3-K/Akt- und des Ras/Raf/MEK/MAPK-Signalweges. Mit Hilfe verschiedener molekularbiologischer und biochemischer Methoden konnte an dieser Stelle eine Beteiligung dieser Signaltransduktionskaskaden infolge der TrkA-Aktivierung auch für die Orthovanadat-vermittelte Neuroprotektion nachgewiesen werden. Aus den durchgeführten Untersuchungen der vorliegenden Arbeit geht eindeutig hervor, dass eine Hemmung der Protein-Tyrosin-Phosphatasen durch Orthovanadat die Phosphorylierung und Aktivierung des hochaffinen NGF-Rezeptors TrkA auch in Abwesenheit von NGF induziert und dieses zu neuroprotektiven Effekten mittels Aktivierung der PI3-K/Akt-Signaltransduktionskaskade und der Aktivierung der Ras/Raf/MEK-MAPK-Kaskade führt. Die Hemmung von Protein-Tyrosin-Phosphatasen könnte somit eine neue, vielversprechende Strategie sein, die neuroprotektive Wirkung der Wachstumsfaktoren zu imitieren, um so im Verlauf chronisch degenerativer Hirnerkrankungen vor neuronalem Zelltod zu schützen. Die für die Dephosphorylierung des TrkA-Rezeptors verantwortliche Protein-Tyrosin-Phosphatase war bis dato unbekannt. In der vorliegenden Arbeit konnte sowohl eine Verlängerung der NGF-induzierten TrkA-Phosphorylierung durch den spezifischen PTP-1B-Inhibitor Compound 2 nachgewiesen werden, als auch eine konzentrations- und zeitabhängige Dephosphorylierung des hochaffinen NGF-Rezeptors nach Behandlung mit rekombinanter PTP-1B. Aufgrund der hier durchgeführten Experimente besteht Anlass zur Hoffnung, dass die PTP-1B die für die TrkA-Dephosphorylierung verantwortliche Phosphatase ist. Somit könnte die Hemmung der PTP-1B ein probater Mechanismus zur Induktion der TrkA-Phosphorylierung und der dadurch vermittelten Neuroprotektion sein. Studien früherer Arbeiten zeigen das ambivalente Verhalten von Stickstoffmonoxid hinsichtlich der neuronalen Degeneration. Hohe Konzentrationen induzieren toxische Effekte, niedrige Konzentrationen hingegen vermitteln antiapoptotische Effekte, deren Mechanismen gerade auf neuronaler Ebene nahezu unbekannt sind und durch die durchgeführten Experimente weiter aufgedeckt wurden. In der vorliegenden Arbeit konnten nicht nur eine NO-Freisetzung für bestimmte Dephostatin-Derivate gemessen werden, sondern auch antiapoptotische Effekte. Die hierfür verantwortlichen Mechanismen ließen eine Beteiligung der löslichen Guanylatcyclase vermuten, welche sowohl für die neuroprotektiven Effekte der Dephostatin-Derivate als auch für den NO-Donator SNAP demonstriert wurden. Für einige NO-Donatoren sind hemmende Eigenschaften hinsichtlich diverser Protein-Tyrosin-Phosphatasen beschrieben worden. Die dadurch vermittelten Effekte waren aber nahezu unbekannt. Mittels der dargestellten Ergebnisse konnten nicht nur eine SNAP-induzierte TrkA-Phosphorylierung belegt werden, sondern auch gezeigt werden, dass die Dephostatin-Derivate neben der Neuroprotektion eine transiente Phosphorylierung des hochaffinen NGF-Rezeptors induzieren. Ferner konnte aufgrund dieser TrkA-Aktivierung die Beteiligung des PI3-K/Akt- und des Ras/Raf/MEK/MAPK-Signaltransduktionsweges an der NO-induzierten Neuroprotektion nachgewiesen werden. Somit erlauben die Befunde der vorliegenden Arbeit die Schlussfolgerung, dass ein positiver Zusammenhang zwischen NO-induzierter Neuroprotektion und Aktivierung der neuroprotektiven PI3-K/Akt- und der MEK/MAPK-Signalwege besteht. Die Aktivierung des hochaffinen NGF-Rezeptors TrkA und nachgeschalteter neuroprotektiver Signaltransduktionswegen durch die NO-Donatoren könnte eine neue, vielversprechende Strategie sein, um in die pathophysiologischen Mechanismen des neuronalen Zelltods einzugreifen und so neue Arzneistoffe zur Behandlung neurodegenerativer Erkrankungen zu entwickeln

Die Rolle von p53 und der Proteinphosphatase 2C in der neuronalen Apoptose

Störungen der neuronalen Apoptose sind an einer ganzen Reihe von Krankheitsbildern beteiligt, darunter so häufige wie Krebs, neurodegenerative Erkrankungen und Schlaganfall. Daher ist es wichtig, die zugrundeliegenden Signalwege zu untersuchen, um die Zusammenhänge aufzuklären und die Möglichkeit der therapeutischen Intervention zu schaffen. Im ersten Teil der vorliegenden Untersuchungen wurden die neuroprotektiven Eigenschaften des p53-Inhibitors Pifithrin-a im in vivo-Modell der transienten globalen Ischämie der Ratte getestet. Die Vorbehandlung mit dem Hemmstoff konnte die Schädigung der hippokampalen CA1-Neurone reduzieren; Pifithrin-a war damit neuroprotektiv. Der Schwerpunkt der Arbeit lag auf der Untersuchung der Rolle der Proteinphosphatase 2C in der ölsäureinduzierten Apoptose. Die Isoformen a und b dieser magnesiumabhängigen Serin/Threonin-Phosphatase werden durch Fettsäuren mit definierten Strukturmerkmalen aktiviert. Für die PP2C-aktivierende Ölsäure konnte im übrigen gezeigt werde, dass sie in bestimmten Systemen Apoptose hervorruft. Um herauszufinden, ob zwischen diesen Ereignissen ein Zusammenhang besteht, wurde zunächst ein Modell etabliert, in dem die Ölsäure in der humanen Neuroblastom-Zelllinie SH-SY5Y konzentrations- und zeitabhängig Apoptose auslöst. Schließlich wurde gezeigt, dass PP2C-aktivierende Fettsäuren sowohl SH-SY5Y-Zellen als auch kultivierte embryonale kortikale Neurone der Ratte schädigen konnten, während nicht-aktivierende zwar ebenso gut von den Zellen aufgenommen wurden, aber keine Apoptose zu induzieren vermochten. PP2Ca wird im Zytosol der SH-SY5Y-Zellen exprimiert, die PP2Cb zusätzlich im Zellkern. Die Behandlung mit Ölsäure änderte nichts an der durch Western Blotting und Immunzytochemie detektierten PP2C-Menge in der Zelle. Auch das PP2C-Substrat Bad wurde untersucht; da es ebenfalls im Zytosol lokalisiert ist, kann es prinzipiell auch in der Zelle mit der PP2C interagieren. Allerdings konnten nach der Behandlung mit Ölsäure eine Regulation weder von Gesamt-Bad noch von phosphoryliertem Bad, detektiert nach Immunpräzipitation, gezeigt werden. Zur Klärung der Beteiligung von Bad an der ölsäureinduzierten Apoptose sind daher weitere Untersuchungen notwendig. Da gegenwärtig noch keine spezifischen PP2C-Inhibitoren verfügbar sind, wurde ein Modell etabliert, in dem mit Hilfe der RNA-Interferenz durch gezielten Abbau der entsprechenden mRNA die PP2Ca und PP2Cb spezifisch und gleichzeitig herunterreguliert werden konnten. Schließlich wurden die RNAi-Zellen während des Zeitfensters der Downregulation nach dem üblichen Protokoll mit Ölsäure behandelt: Verglichen mit der entsprechenden Kontrolle waren die SH-SY5Y-Zellen mit reduziertem PP2C-Gehalt weniger stark geschädigt. Die Proteinphosphatase 2C ist also an der ölsäureinduzierten Apoptose von SH-SY5Y-Zellen beteiligt; ihre Hemmung, sei es durch Knockdown oder Inhibitoren, reduziert den Zelltod und könnte damit eine Möglichkeit auch zum therapeutischen Eingriff bei Zuständen mit pathologisch gesteigerter Apoptose bieten

Dephosphorylation of Centrins by Protein Phosphatase 2C α and β

In the present study, we identified protein phosphatases dephosphorylating centrins previously phosphorylated by protein kinase CK2. The following phosphatases known to be present in the retina were tested: PP1, PP2A, PP2B, PP2C, PP5, and alkaline phosphatase. PP2C α and β were capable of dephosphorylating P-Thr138-centrin1 most efficiently. PP2Cδ was inactive and the other retinal phosphatases also had much less or no effect. Similar results were observed for centrins 2 and 4. Centrin3 was not a substrate for CK2. The results suggest PP2C α and β to play a significant role in regulating the phosphorylation status of centrins in vivo

Binding of ATP to vascular endothelial growth factor isoform VEGF-A165 is essential for inducing proliferation of human umbilical vein endothelial cells

<p>Abstract</p> <p>Background</p> <p>ATP binding is essential for the bioactivity of several growth factors including nerve growth factor, fibroblast growth factor-2 and brain-derived neurotrophic factor. Vascular endothelial growth factor isoform 165 (VEGF-A₁₆₅) induces the proliferation of human umbilical vein endothelial cells, however a dependence on ATP-binding is currently unknown. The aim of the present study was to determine if ATP binding is essential for the bioactivity of VEGF-A₁₆₅.</p> <p>Results</p> <p>We found evidence that ATP binding toVEGF-A₁₆₅induced a conformational change in the secondary structure of the growth factor. This binding appears to be significant at the biological level, as we found evidence that nanomolar levels of ATP (4-8 nm) are required for the VEGF-A₁₆₅-induced proliferation of human umbilical vein endothelial cells. At these levels, purinergic signaling by ATP <it>via </it>P2 receptors can be excluded. Addition of alkaline phosphate to cell culture lowered the ATP concentration in the cell culture medium to 1.8 nM and inhibited cell proliferation.</p> <p>Conclusions</p> <p>We propose that proliferation of endothelial cells is induced by a VEGF-A₁₆₅-ATP complex, rather than VEGF-A₁₆₅alone.</p

MALDI-TOF High Mass Calibration up to 200 kDa Using Human Recombinant 16 kDa Protein Histidine Phosphatase Aggregates

Background: Protein histidine phosphatase (PHP) is an enzyme which removes phosphate groups from histidine residues. It was described for vertebrates in the year 2002. The recombinant human 16 kDa protein forms multimeric complexes in physiological buffer and in the gas phase. High-mass calibration in matrix-assisted laser desorption/ionization time-of-flight mass spectrometry (MALDI-TOF MS) has remained a problem due to the lack of suitable standards. Large proteins can hardly be freed of their substructural microheterogeneity by classical purification procedures so that their use as calibrants is limited. A small adduct-forming protein of validated quality is a valuable alternative for that purpose. Methodology/Principal Findings: Three major PHP clusters of ,113, 209 and .600 kDa were observed in gel filtration analysis. Re-chromatography of the monomer peak showed the same cluster distribution. The tendency to associate was detected also in MALDI-TOF MS measuring regular adducts up to 200 kDa. Conclusions/Significance: PHP forms multimers consisting of up to more than 35 protein molecules. In MALDI-TOF MS it generates adduct ions every 16 kDa. The protein can be produced with high quality so that its use as calibration compound for high mass ranges above 100 kDa, where standards are difficult to obtain, is feasible

Acetylcholine content and viability of cholinergic neurons are influenced by the activity of protein histidine phosphatase

Background: The first mammalian protein histidine phosphatase (PHP) was discovered in the late 90s of the last century. One of the known substrates of PHP is ATP-citrate lyase (ACL), which is responsible - amongst other functions - for providing acetyl-CoA for acetylcholine synthesis in neuronal tissues. It has been shown in previous studies that PHP downregulates the activity of ACL by dephosphorylation. According to this our present work focused on the influence of PHP activity on the acetylcholine level in cholinergic neurons. Results: The amount of PHP in SN56 cholinergic neuroblastoma cells was increased after overexpression of PHP by using pIRES2-AcGFP1-PHP as a vector. We demonstrated that PHP overexpression reduced the acetylcholine level and induced cell death. The acetylcholine content of SN56 cells was measured by fast liquid chromatographytandem mass spectrometry method. Overexpression of the inactive H53A-PHP mutant also induced cell damage, but in a significantly reduced manner. However, this overexpression of the inactive PHP mutant did not change the acetylcholine content of SN56 cells significantly. In contrast, PHP downregulation, performed by RNAitechnique, did not induce cell death, but significantly increased the acetylcholine content in SN56 cells. Conclusions: We could show for the first time that PHP downregulation increased the acetylcholine level in SN56 cells. This might be a potential therapeutic strategy for diseases involving cholinergic deficits like Alzheimer’s disease

MALDI-TOF High Mass Calibration up to 200 kDa Using Human Recombinant 16 kDa Protein Histidine Phosphatase Aggregates

Background: Protein histidine phosphatase (PHP) is an enzyme which removes phosphate groups from histidine residues. It was described for vertebrates in the year 2002. The recombinant human 16 kDa protein forms multimeric complexes in physiological buffer and in the gas phase. High-mass calibration in matrix-assisted laser desorption/ionization time-of-flight mass spectrometry (MALDI-TOF MS) has remained a problem due to the lack of suitable standards. Large proteins can hardly be freed of their substructural microheterogeneity by classical purification procedures so that their use as calibrants is limited. A small adduct-forming protein of validated quality is a valuable alternative for that purpose. Methodology/Principal Findings: Three major PHP clusters of,113, 209 and.600 kDa were observed in gel filtration analysis. Re-chromatography of the monomer peak showed the same cluster distribution. The tendency to associate was detected also in MALDI-TOF MS measuring regular adducts up to 200 kDa. Conclusions/Significance: PHP forms multimers consisting of up to more than 35 protein molecules. In MALDI-TOF MS it generates adduct ions every 16 kDa. The protein can be produced with high quality so that its use as calibration compoun

The Design and Construction of Transverter for Amateur Radio Band 144MHz

Předkládaná bakalářská práce se zabývá návrhem a konstrukcí transvertoru pro radioamatérské pásmo 144 MHz. První kapitola obsahuje popis požadovaných parametrů a vlastnosti, kterých má navrhované zařízení dosáhnout, ve druhé kapitole jsou uvedeny zákonem požadované parametry. Další kapitoly se zabývají samotným návrhem schéma, simulací parametrů, výběrem součástek, v šesté kapitole se nachází návrh plošného spoje. Poslední kapitoly obsahují měření a porovnání simulovaných a naměřených parametrů. V závěru práce je provedeno zhodnocení dosažených výsledků a možné pokračování vývoje.Katedra elektromechaniky a výkonové elektronikyObhájenoThis bachelor thesis deals with the design and construction of the transverter for 144 MHz radio amateur band. The first chapter introduces required characteristics and parameters which the proposed device should achieve, the second chapter lists parameters required by the law. The other chapters deal with scheme design, simulation of parameters, components selection, finally, the sixth chapter presents the design of printed circuit board. The last chapter contains the measurement and comparison between simulated and measured device parameters. Evaluation of the results is shown at the end of this thesis also with the suggestions for further development

Design and implementation of input multiplexer card for measurement chassis MX2400

Předkládaná diplomová práce se zabývá návrhem vstupní multiplexerové karty pro měřící ústřednu MX2400. První kapitola obsahuje rozbor požadavků ICT, FT a WH testů, porovnání testerů a multiplexerových karet dostupných na trhu. Druhá kapitola provádí rozbor spínačů pro vstupní multiplexerové karty a dále uvádí rozdíly, výhody a nevýhody elektromechanických a polovodičových spínačů. Ve třetí kapitole je provedena analýza a výběr nejvhodnějších spínačů s ohledem na požadavky. Ve čtvrté kapitole je popsán návrh zapojení spínače a jeho řízení. V páté kapitole jsou popsány všechny části obvodového zapojení, přičemž tato kapitola je rozdělena na jednotlivé části multiplexerové karty. Návrh plošného spoje, rozmístění součástek se nachází v kapitole šesté. V sedmé kapitole je vzorový testovací program v prostředí funTEST. V osmé kapitole je měření stávající a nově navržené multiplexerové karty a jejich porovnání. V deváté kapitole je ekonomické zhodnocení nově navržené karty.ObhájenoThis master thesis deals with the multiplexer input card for measuring chassis MX2400. The first chapter provides an analysis of the requirements of ICT, FT and WH tests, comparison testers and multiplexer cards available on the market. The second chapter performs the analysis of switches for multiplexer input cards and presents the differences, advantages and disadvantages of electromechanical and semiconductor switches. The third chapter includes analysis and selection of the most appropriate switches chosen according to the requirements. In the fourth chapter is described the design of the switch and its driving. Fifth chapter describes the design of all parts of input card, this chapter is divided into parts according to the parts of multiplexer card. PCB proposal and component placement are in the sixth chapter. In the seventh chapter is an example of testing program in funTEST environment. The eight chapter explains and presents measuring and comparison of the existing and newly designed card. The economic evaluation of newly designed card is described in the ninth chapter