Die Rolle der AMP-Kinase bei der Regulation des Vasotonus

In der vorliegenden Arbeit wurde die potentielle Rolle der AMP-Kinase, eines der Schlüsselenzyme im Energiestoffwechsel, bei der Regulation des Vasotonus kleiner arterieller Blutgefäße untersucht und die Effekte einer AMPK-Stimulation mit der EDHF-vermittelten endothelialen Dilatation verglichen. Mittels Western-Blot Technik wurde auf Proteinebene nachgewiesen, dass in Arterien des Hamsters sowohl die α1-Untereinheit der AMPK - als prädominante katalytische Untereinheit - sowie die β1-Untereinheit der AMPK exprimiert werden. Die funktionellen Untersuchungen erfolgten an isoliert perfundierten Widerstandsarterien aus der Skelettmuskulatur des Hamsters. An diesen wurden gleichzeitige Registrierungen des Außendurchmessers als Maß für den Vasotonus sowie der intrazellulären Kalziumkonzentration in der glatten Gefäßmuskulatur (Kalziumindikator Fura 2) nach Zugabe verschiedener vasoaktiver Substanzen durchgeführt. An mit Noradrenalin vorkontrahierten isolierten Gefäßen führte der auf die β1-Untereinheit wirkende AMPK-Aktivator A769662 (A76) endothelunabhängig zu einer maximalen Dilatation der Gefäße, die mit einem erheblichen Abfall des glattmuskulären Kalziumspiegels einherging. Die beobachteten A76 Effekte auf Gefäßtonus und Kalziumspiegel waren dosisabhängig. Der Vasodilatator Acetylcholin löste ebenfalls einen ausgeprägten Kalziumabfall in der glatten Muskulatur aus. Dies war jedoch nur bei einem intakten Endothel zu beobachten. Eine Transfektion kultivierter Gefäße mit einer dominant negativ Variante der α1-Untereinheit der AMPK führte zu einer partiellen Herabsetzung der Dilatation und des Kalziumabfalls. Zwei weitere Aktivatoren der AMPK, AICAR und Metformin, bewirkten an den Widerstandsgefäßen ebenfalls eine statistisch signifikante Dilatation und einen Kalziumabfall. An Gefäßen, welche anstelle von Noradrenalin durch eine hohe extrazelluläre Kaliumkonzentration vorkontrahiert wurden, ließ sich nach Stimulation mit A76 weder eine Dilatation noch ein Kalziumabfall feststellen, welches als ein Hinweis auf eine Beteiligung von Kaliumkanälen an den A76 mediierten Effekten zu werten war. Zur genaueren Evaluation dieser Hypothese wurden die A76 Effekte nach pharmakologischer Blockade verschiedener Kaliumkanäle untersucht. Hierbei zeigte sich, dass Iberiotoxin, ein selektiver Inhibitor von BKCa-Kanälen keinen Einfluss auf eine A76 vermittelte Dilatation hatte. Ebenso wenig wurde eine Acetylcholin vermittelte Vasodilatation blockiert. Demgegenüber führte Charybdotoxin, ein Hemmer von BKCa-Kanälen und IKCa-Kanälen, zwar zu einer Blockade der Acetylcholinantwort, ließ die A76 Effekte jedoch weitgehend unbeeinflusst. Die Blockade von ATP-abhängigen Kaliumkanälen KATP durch Glibenclamid in hohen Konzentrationen bewirkte hingegen eine deutliche Reduktion sowohl der Dilatation als auch des Kalziumabfalls nach Gabe von A76. Insgesamt konnte im Rahmen dieser Arbeit damit gezeigt werden, dass eine Aktivierung der AMPK in isolierten Widerstandsgefäßen des Hamsters zu einer schnellen und ausgeprägten Vasodilatation führt, welche durch einen vorhergehenden Abfall der intrazellulären Kalziumkonzentration in der glatten Gefäßmuskulatur initiiert wird. Die Hemmwirkung von Glibenclamid weist darauf hin, dass dieser Dilatation ein Effekt der AMPK auf KATP-Kanäle in der glatten Muskulatur zu Grund liegen könnte

GLUT1 expression is increased in hepatocellular carcinoma and promotes tumorigenesis

Accelerated glycolysis is one of the biochemical characteristics of cancer cells. The glucose transporter isoform 1 (GLUT1) gene encodes a key rate-limiting factor in glucose transport into cancer cells. However, its expression level and functional significance in hepatocellular cancer (HCC) are still disputed. Therefore, we aimed to analyze the expression and function of the GLUT1 gene in cases of HCC. We found significantly higher GLUT1 mRNA expression levels in HCC tissues and cell lines compared with primary human hepatocytes and matched nontumor tissue. Immunohistochemical analysis of a tissue microarray of 152 HCC cases revealed a significant correlation between Glut1 protein expression levels and a higher Ki-67 labeling index, advanced tumor stages, and poor differentiation. Accordingly, suppression of GLUT1 expression by siRNA significantly impaired both the growth and migratory potential of HCC cells. Furthermore, inhibition of GLUT1 expression reduced both glucose uptake and lactate secretion. Hypoxic conditions further increased GLUT1 expression levels in HCC cells, and this induction was dependent on the activation of the transcription factor hypoxia-inducible factor-1alpha. In summary, our findings suggest that increased GLUT1 expression levels in HCC cells functionally affect tumorigenicity, and thus, we propose GLUT1 as an innovative therapeutic target for this highly aggressive tumor

Lactic acid and acidification inhibit TNF secretion and glycolysis of human monocytes

High concentrations of lactic acid (LA) are found under various pathophysiological conditions and are accompanied by an acidification of the environment. To study the impact of LA on TNF secretion, human LPS-stimulated monocytes were cultured with or without LA or the corresponding pH control. TNF secretion was significantly suppressed by low concentrations of LA (< or = 10 mM), whereas only strong acidification had a similar effect. This result was confirmed in a coculture model of human monocytes with multicellular tumor spheroids. Blocking synthesis of tumor-derived lactate by oxamic acid, an inhibitor of lactate dehydrogenase, reversed the suppression of TNF secretion in this coculture model. We then investigated possible mechanisms underlying the suppression. Uptake of [3-(13)C]lactate by monocytes was shown by hyphenated mass spectrometry. As lactate might interfere with glycolysis, the glycolytic flux of monocytes was determined. We added [1,2-(13)C(2)]glucose to the culture medium and measured glucose uptake and conversion into [2,3-(13)C(2)]lactate. Activation of monocytes increased the glycolytic flux and the secretion of lactate, whereas oxygen consumption was decreased. Addition of unlabeled LA resulted in a highly significant decrease in [2,3-(13)C(2)]lactate secretion, whereas a mere corresponding decrease in pH exerted a less pronounced effect. Both treatments increased intracellular [2,3-(13)C(2)]lactate levels. Blocking of glycolysis by 2-deoxyglucose strongly inhibited TNF secretion, whereas suppression of oxidative phosphorylation by rotenone had little effect. These results support the hypothesis that TNF secretion by human monocytes depends on glycolysis and suggest that LA and acidification may be involved in the suppression of TNF secretion in the tumor environment

AMPK dilates resistance arteries via activation of SERCA and BK_Ca channels in smooth muscle

The protective effects of 5-AMP-activated protein kinase (AMPK) on the metabolic syndrome may include direct effects on resistance artery vasomotor function. However, the precise actions of AMPK on microvessels and their potential interaction are largely unknown. Thus, we set to determine the effects of AMPK activation on vascular smooth muscle tone and the underlying mechanisms. Resistance arteries isolated from hamster and mouse exhibited a pronounced endothelium-independent dilation on direct pharmacological AMPK activation by 2 structurally unrelated compounds (PT1 and A769662). The dilation was associated with a decrease of intracellular-free calcium [Ca2+](i) in vascular smooth muscle cell. AMPK stimulation induced activation of BKCa channels as assessed by patch clamp studies in freshly isolated hamster vascular smooth muscle cell and confirmed by direct proof of membrane hyperpolarization in intact arteries. The BKCa channel blocker iberiotoxin abolished the hyperpolarization but only partially reduced the dilation and did not affect the decrease of [Ca2+](i). By contrast, the sarcoplasmic/endoplasmic Ca2+-ATPase (SERCA) inhibitor thapsigargin largely reduced these effects, whereas combined inhibition of SERCA and BKCa channels virtually abolished them. AMPK stimulation significantly increased the phosphorylation of the SERCA modulator phospholamban at the regulatory T17 site. Stimulation of smooth muscle AMPK represents a new, potent vasodilator mechanism in resistance vessels. AMPK directly relaxes vascular smooth muscle cell by a decrease of [Ca2+](i). This is achieved by calcium sequestration via SERCA activation, as well as activation of BKCa channels. There is in part a mutual compensation of both calcium-lowering mechanisms. However, SERCA activation which involves an AMPK-dependent phosphorylation of phospholamban is the predominant mechanism in resistance vessels