Functional characterisation of calcium-activated chloride channel 2 (CLCA2) in human tumour cells

Die Identifikation von neuen tumorspezifischen Genen und Signalwegen ist eine Schlüsselstrategie, um neue zusätzliche prognostische Marker und molekulare Targets für chemische und/oder immunologische Therapien zu finden. Eigene Arbeiten führten mittels Kombination von subtraktiven cDNA Banken und cDNA Gen-Chips zur Identifikation des humanen Kalzium-aktivierten Chloridkanals 2 (CLCA2), als ein Gen, das im Plattenepithelkarzinom der Lunge überexprimiert wird [1]. Die Anwesenheit von T-Zell Epitopen und dessen immunologische Eigenschaften wurden ebenfalls von uns beschrieben [2]. CLCA2 ist ein Familienmitglied der Kalzium-aktivierten cytoplasmatischen transmembranen Chloridkanal Proteine [3]. Vier humane Mitglieder wurden bislang identifiziert, drei davon werden proteolytisch in zwei Untereinheiten gespalten, wobei CLCA3 ein trunkiertes segregiertes Protein ist [4]. Im Unterschied zu anderen Familienmitgliedern zeigt CLCA2 ein sehr restriktives Expressionsprofil in Normalgeweben (Larynx, Ösophagus, Haut). Im Zuge der vorliegenden Dissertation konnte eine präferenzielle Überexpression vom CLCA2 in humanen Plattenepithelkarzinomen verschiedenen Ursprungs, wie auch deren korrespondierender Lymphknoten-Metastasen nachgewiesen werden. Zusätzlich konnte eine Überexpression auch in Mycosis fungoides (einem T-Zell Lymphom, das vorwiegend die Haut betrifft) und in einer Untergruppe von infiltrierenden duktalen Brustkarzinomen gezeigt werden. Präliminäre immunohistochemische Analysen bestätigten die Expression von CLCA2 in Proben von humanen Plattenepithelkarzinomen. In silico Transkriptionsanalysen weisen auf einen dramatischen Anstieg der CLCA2 Expression hin, wenn Plattenepithelkarzinom-Zelllinien in einem Xenograft-Nacktmaus-Modell implantiert werden, was Rückschlüsse auf eine mögliche Rolle von CLCA2 in der späten Phase der Tumorgenese zulässt. Das Ausschalten der Funktion von CLCA2 in Plattenepithelkarzinomen mittels siRNA führte zur Inhibition der Proliferation, zur Reduktion der Viabilität, zur Induktion von apoptotischen Prozessen und zu einem Arrest in der G2-Phase des Zellzykluses. Im Vergleich dazu, blieben Brustkarzinom-Zelllinien - zumindest in 2D-Zellkulturen - davon unbeeinflusst. Induzierte Expression von CLCA2 in Tumorzellen in Kombination mit Mutationsanalyse wiesen eine proteolytische (höchstwahrscheinlich autokatalytische) Prozessierungsaktivität (Hydrolaseaktivität) von CLCA2 nach und lassen die Präsenz einer strukturellen Metallallionen-Stelle für die Koordination von Zn2+ vermuten. Zusammengefasst weisen diese Daten auf eine Zincin-ähnliche Hydrolasedomäne in der N-terminalen Region von CLCA2 hin. Wie in bioinformatischen Analysen vorhergesagt und in Analogie zu CLCA1, konnte eine „monobasische Spaltstelle“ durch „Alanin-walking“ bestätigt werden, wobei die vorhergesagte Spaltstelle sich wie folgt präsentiert: P3(Tyr/Phe) – P2(X) – P1(Arg/Lys) – P1’(Tyr/Phe) – P2’(Phe/Ala). Inhibition der Glykkosylierung zeigte, dass dadurch sowohl die Stabilität als auch die proteolytische Prozessierung beeinträchtigt werden. Für eine bessere Simulation der Situation in einem Tumor wurden CLCA2-exprimiernde Klone in multizellulären Tumor-Sphäroiden kultiviert. Im Vergleich zu 2D-Kulturen konnte ein über 2,5-facher Anstieg der relativen Proliferationsrate in der dreidimensionalen Kultur aufgrund von CLCA2 Expression nachgewiesen werden. Für ein besseres Verständnis der Beteiligung von CLCA2 in der Signaktransduktion, wurde eine umfassende Transkriptionsprofilierungs-Studie mit Affymetrix Gen-Chips durchgeführt. Im Anschluss daran folgten weitere Untersuchungen durch quantitative Real-Time PCR und Phospho-Protein Studien mit ausgewählten Genen. Insgesamt konnte gezeigt werden, dass aufgrund von CLCA2-Induktion ~ 150 Gene differentiell reguliert sind. Unter anderem sind das CDIPT, MLL2 und SFI1, welche eine wichtige Rolle in der Zellzyklus-Regulation spielen. Durch die Verwendung von „Ingenuity Pathways Analysis“ – einem „text- and data-mining“ – Analysenprogramm konnten Interaktionsnetzwerke identifiziert werden, die allesamt in Verbindung mit wichtigen kanonischen Signaltransduktionskaskaden oder Interaktionsnetzwerken gebracht werden können, wie etwa das TNF–IL2–IL10 Interaktionsnetzwerk, oder die ERK–MAPK Signalkaskade. Phosphoproteom Studien bestätigten in der Folge diese Ergebnisse und konnten zusätzlich den Zusammenhang dieser Interaktionsnetzwerke mit translationaler Modulation aufzeigen. Obwohl die Daten der Transkriptionsprofilierung nur ein vorläufiges Zwischenergebnis darstellen, dienen sie als gute Ausgangsbasis für die Planung weiterer Studien zur Charakterisierung von CLCA2 als ein vielversprechendes Target in der Plattenepithel-Tumorgenese.Identification of novel tumour-specific genes and pathways is a key strategy to gain additional prognostic markers and to identify molecular targets for chemical and/or immunological therapy. Combination of subtractive cDNA libraries and cDNA microarrays lead us to identify the human calcium-activated chloride channel 2 (CLCA2) as one gene being highly expressed in lung squamous cell carcinoma (lung SCC) [1]. The presence of T cell epitopes of CLCA2 and its immunological properties have also been described by our group [2]. CLCA2 is a member of the family of calcium-activated cytoplasmic trans-membrane chloride channel proteins [3]. Four human members have been identified, three of them are proteolytically processed into two subunits, whereas CLCA3 represents a truncated and secreted protein [4]. In contrast to other family members, CLCA2 displays a very restricted expression profile in normal tissues (larynx, esophagus, skin). In the course of this PhD-Thesis a preferential overexpression of CLCA2 in human squamous cell carcinomas (SCC) of different origins, including their lymph node metastases, could be demonstrated. In addition, overexpression was also detected in mycosis fungoides, a cutaneous T cell lymphoma, and in a subset of infiltrating ductal breast cancers. Preliminary IHC analyses confirmed expression of CLCA2 in human SCC samples. In silico expression analyses of xenografted SCC cell lines into nude mice revealed a dramatic increase in CLCA2 expression, suggesting a role of CLCA2 in late stage tumourigenesis. Loss-of-function studies in SCC cell lines by siRNA-mediated knock-down of CLCA2 lead to inhibition of proliferation, reduction in viability, subsequently to induction of apoptotic processes, and to an arrest in G2-phase of the cell cycle. In contrast, breast cancer cell lines stayed unaffected at least in 2D-tissue culture. Inducible expression of CLCA2 in tumour cells in combination with a detailed mutational analysis demonstrated a proteolytic (most likely autocatalytic) processing (hydrolase) activity of CLCA2 and proposed a structural metal site for Zn2+ coordination. Altogether, these data strongly support the presence of a zincin-like hydrolase domain in the N-terminal region of CLCA2. As predicted by bioinformatic analyses and in analogy to CLCA1 a monobasic cleavage site could be confirmed by “Alanine-walking” mutagenesis, with the predicted cleavage recognition site: P3(Tyr/Phe) – P2(X) – P1(Arg/Lys) – P1’(Tyr/Phe) – P2’(Phe/Ala). Inhibition of glycosylation revealed that both, the stability and the proteolytic processing are impaired when glycosylation is inhibited. For a better simulation of the situation in a tumour, CLCA2-expressing clones were also grown in multicellular tumour spheroids. In contrast to growth in 2D-cultures a > 2.5-fold increase in the relative proliferation rate in the three-dimensional culture could be identified upon induction of CLCA2 expression. For a better understanding of the involvement of CLCA2 in signal transduction a comprehensive expression profiling study on Affymetrix GeneChips was performed followed by RT-qPCR and phospho-proteom studies with selected genes. In total ~ 150 genes were shown to be differentially regulated upon induction of CLCA2 expression. Among those genes are CDIPT, MLL2, and SFI1 which play an important role in cell cycle regulation. Utilising Ingenuity Pathways Analysis – a text- and data-mining program – several interaction-networks were identified. All of them could be linked with important canonical signal transduction cascades or interaction networks such as the TNF–IL2–IL10 interaction network or the ERK–MAPK signaling cascade. Phospho-proteom studies confirmed these findings and additionally identified a strong impact of CLCA2 on translational modulation. Although these expression profiling data can only be regarded as preliminary they, however, offer the basis for further focused studies for the characterisation of CLCA2 as a promising target in SCC tumourigenesis

The leader region of Laminin B1 mRNA confers cap-independent translation

Translation initiation of eukaryotic mRNAs generally occurs by cap-dependent ribosome scanning. However, certain mRNAs contain internal ribosome entry sites (IRES) allowing cap-independent translation. Several of these IRES-competent transcripts and their corresponding proteins are involved in tumourigenesis. This study focused on IRES-driven translation control during the epithelial to mesenchymal transition (EMT) of hepatocytes that reflects crucial aspects of carcinoma progression. Expression profiling of EMT revealed Laminin B1 (LamB1) to be translationally upregulated. The 5′-untranslated region (UTR) of LamB1 was potent to direct IRES-dependent mRNA utilization of a bicistronic reporter construct. Stringent assays for cryptic promoter and splice sites showed no aberrantly expressed transcripts, suggesting that the reporter activity provided by the leader region of LamB1 mRNA exclusively depends on IRES. In accordance, LamB1 expression increased upon negative interference with cap-dependent translation by expression of human rhinovirus 2A protease or heat shock of cells. Finally, the enhanced expression of LamB1 during EMT correlated with an elevated IRES activity. Together, these data provide first evidence that the 5′-UTR of LamB1 contains a bona fide IRES that directs translational upregulation of LamB1 during stress conditions and neoplastic progression of hepatocytes

LamB1 translation after heat shock or intervention with ribosome scanning through 2A protease-dependent cleavage of eIF4G

<p><b>Copyright information:</b></p><p>Taken from "The leader region of Laminin B1 mRNA confers cap-independent translation"</p><p></p><p>Nucleic Acids Research 2007;35(8):2473-2482.</p><p>Published online 29 Mar 2007</p><p>PMCID:PMC1885646.</p><p>© 2007 The Author(s)</p> () LamB1 expression in MIM-R cells 4, 6 and 8 h after heat shock as detected by western blotting. () Firefly luciferase assay of MIM-R hepatocytes transfected either with pR-EMCV-F or pR-Lam-F bicistronic plasmids. Cells were exposed to heat shock 12 h post-transfection. 48 hours after transfection, Firefly luciferase activity was determined and normalized to the RNA level after reverse transcription and quantitation of cDNA. () Western blot analysis of MIM-R cells showing the cleavage of eIF4GI/II. MIM-R cells were transfected with wild-type 2A protease expressing plasmid (p2Awt) and lysed at the indicated times. () Firefly luciferase assay of MIM-R hepatocytes co-transfected with pR-F and either p2Amut or p2Awt. () Firefly luciferase assay of MIM-R cells co-transfected either with pR-EMCV-F or pR-Lam-F and p2Amut or p2Awt, respectively. Cells were lysed 48 h post-transfection and the Firefly luciferase activity was normalized to the RNA level after reverse transcription and quantitation of cDNA