Photosynthesis in Plants Undergoing Silencing

RNA silencing shares common features among different eukaryotes. However little is known about the metabolic consequences of this mechanism relate to the (plant) cell homeostasis. Here, we probe the chlroroplast bioenergetics in transgenic plants undergoing silencing. An increased capacity for non-photochemical energy quenching followed by a limiting photosystem II functionality characterize the photosynthesis of silenced cells compared to non-silenced ones. These alterations are accompanied by a significant up-regulation of photosystem I, providing evidence for active cyclic electron flow in silencing conditions. The biological significance of our results is discussed related to possible energetic inter-communication between photosynthesis and RNA silencing

Light intensity affects RNA silencing of a transgene in Nicotiana benthamiana plants

Abstract Background Expression of exogenous sequences in plants is often suppressed through one of the earliest described RNA silencing pathways, sense post-transcriptional gene silencing (S-PTGS). This type of suppression has made significant contributions to our knowledge of the biology of RNA silencing pathways and has important consequences in plant transgenesis applications. Although significant progress has been made in recent years, factors affecting the stability of transgene expression are still not well understood. It has been shown before that the efficiency of RNA silencing in plants is influenced by various environmental factors. Results Here we report that a major environmental factor, light intensity, significantly affects the induction and systemic spread of S-PTGS. Moreover, we show that photoadaptation to high or low light intensity conditions differentially affects mRNA levels of major components of the RNA silencing machinery. Conclusions Light intensity is one of the previously unknown factors that affect transgene stability at the post-transcriptional level. Our findings demonstrate an example of how environmental conditions could affect RNA silencing.</p

The extraordinary longevity of kleptoplasts derived from the Ross Sea haptophyte Phaeocystis antarctica within dinoflagellate host cells relates to the diminished role of the oxygen-evolving Photosystem II and to supplementary light harvesting by mycosporine-like amino acid/s

The haptophyte Phaeocystis antarctica and the novel Ross Sea dinoflagellate that hosts kleptoplasts derived from P. antarctica (RSD; R.J. Gast et al., 2006, J.Phycol. 42233-242) were compared for photosynthetic light harvesting and for oxygen evolution activity. Both chloroplasts and kleptoplasts emit chlorophyll a (Chl a) fluorescence peaking at 683 nm (F683) at 277 K and at 689 (F689) at 77 K. Second derivative analysis of the F689 band at 77 K revealed two individual contributions centered at 683 nm (Fi-683) and at 689 (Fi-689). Using the p-nitrothiophenol (p-NTP) treatment of Kobayashi et al. (Biochim. Biophys. Acta 423 (1976) 80-90) to differentiate between Photosystem (PS) II and I fluorescence emissions, we could identify PS II as the origin of Fi-683 and PS I as the origin of Fi-689. Both emissions could be excited not only by Chl a-selective light (436 nm) but also by mycosporine-like amino acids (MAAs)-selective light (345 nm). This suggests that a fraction of MAAs must be proximal to Chls a and, therefore, located within the plastids. On the basis of second derivative fluorescence spectra at 77 K, of p-NTP resolved fluorescence spectra, as well as of PSII-driven oxygen evolution activities, PS II appears substantially less active (-1/5) in dinoflagellate kleptoplasts than in P. antarctica chloroplasts. We suggest that a diminished role of PS II, a known source of reactive oxygen species, and a diminished dependence on nucleus-encoded light-harvesting proteins, due to supplementary light-harvesting by MAAs, may account for the extraordinary longevity of RSD kleptoplasts. (C) 2016 Elsevier B.V. All rights reserved

Lipid polymorphism in chloroplast thylakoid membranes - as revealed by 31P-NMR and time-resolved merocyanine fluorescence spectroscopy

Chloroplast thylakoid membranes contain virtually all components of the energy-converting photosynthetic machinery. Their energized state, driving ATP synthesis, is enabled by the bilayer organization of the membrane. However, their most abundant lipid species is a non-bilayer-forming lipid, monogalactosyl-diacylglycerol; the role of lipid polymorphism in these membranes is poorly understood. Earlier 31P-NMR experiments revealed the coexistence of a bilayer and a non-bilayer, isotropic lipid phase in spinach thylakoids. Packing of lipid molecules, tested by fluorescence spectroscopy of the lipophilic dye, merocyanine-540 (MC540), also displayed heterogeneity. Now, our 31P-NMR experiments on spinach thylakoids uncover the presence of a bilayer and three nonbilayer lipid phases; time-resolved fluorescence spectroscopy of MC540 also reveals the presence of multiple lipidic environments. It is also shown by 31P-NMR that: (i) some lipid phases are sensitive to the osmolarity and ionic strength of the medium, (ii) a lipid phase can be modulated by catalytic hydrogenation of fatty acids and (iii) a marked increase of one of the non-bilayer phases upon lowering the pH of the medium is observed. These data provide additional experimental evidence for the polymorphism of lipid phases in thylakoids and suggest that non-bilayer phases play an active role in the structural dynamics of thylakoid membranes

Re-criticizing RNA-mediated cell evolution : a radical perspective

Genetic inter-communication of the nucleic-organellar dual in eukaryotes is dominated by DNA-directed phenomena. RNA regulatory circuits have also been observed in artificial laboratory prototypes where gene transfer events are reconstructed, but they are excluded from the primary norm due to their rarity. Recent technical advances in organellar biotechnology, genome engineering and single-molecule tracking give novel experimental insights on RNA metabolism not only at cellular level, but also on organismal survival. Here, I put forward a hypothesis for RNA's involvement in gene piece transfer, taken together the current knowledge on the primitive RNA character as a biochemical modulator with model organisms from peculiar natural habitats. It is proposed that RNA molecules of special structural signature and functional identity can drive evolution, integrating the ecological pressure of environmental oscillations into genome imprinting by buffering-out epigenetic aberrancies. Copyright © Cambridge University Press 201

Non-coding RNAs' partitioning in the evolution of photosynthetic organisms via energy transduction and redox signaling.

Ars longa, vita brevis -Hippocrates Chloroplasts and mitochondria are genetically semi-autonomous organelles inside the plant cell. These constructions formed after endosymbiosis and keep evolving throughout the history of life. Experimental evidence is provided for active non-coding RNAs (ncRNAs) in these prokaryote-like structures, and a possible functional imprinting on cellular electrophysiology by those RNA entities is described. Furthermore, updated knowledge on RNA metabolism of organellar genomes uncovers novel inter-communication bridges with the nucleus. This class of RNA molecules is considered as a unique ontogeny which transforms their biological role as a genetic rheostat into a synchronous biochemical one that can affect the energetic charge and redox homeostasis inside cells. A hypothesis is proposed where such modulation by non-coding RNAs is integrated with genetic signals regulating gene transfer. The implications of this working hypothesis are discussed, with particular reference to ncRNAs involvement in the organellar and nuclear genomes evolution since their integrity is functionally coupled with redox signals in photosynthetic organisms

The role of light and photosynthesis in the RNA silencing mechanism in plants

Ο όρος RNA σίγηση αναφέρεται σε RNA-εξαρτώμενες διαδικασίες οι οποίες έχουν ως αποτέλεσμα την ειδική ως προς την αλληλουχία ρύθμιση της γονιδιακής έκφρασης, δρώντας στο ρυθμό παραγωγής, στη διάρκεια της ημίσειας ζωής και στην αναλογία της σταθερότητας του mRNA προς τα αντίστοιχα μεταφραστικά του επίπεδα (Brodersen and Voinnet, 2006). Eίναι γνωστό ότι περιβαλλοντικοί παράγοντες επηρεάζουν το μηχανισμό της RNA σίγησης στα φυτά ( Meza et al., 2001; Szittya et al., 2003; Yoo et al., 2004; Sos-Hegedus et al., 2005). Στην παρούσα εργασία μελετήθηκε η επίδραση της φωτονιακής έντασης και ποιότητας στην έναρξη και διασυστηματική εξάπλωση της μετα-μεταγραφικής σίγησης που οφείλεται σε μετάγραφα κωδικής αλληλουχίας, σε διαγονιδιακά φυτά Ν. benthamiana. Τα πειραματικά δεδομένα (Kotakis et al., 2010) έδειξαν ότι ο υψηλής έντασης φωτισμός επηρεάζει θετικά την συχνότητα εμφάνισης σιγητικών φαινομένων (σήμα σίγησης μικρής κλίμακας και διασυστηματικό) σε διαγονιδιακά φυτά που υφίστανται μετα-μεταγραφική σίγηση. Τα επίπεδα των mRNA του διαγονιδίου που μελετήθηκαν στην παρούσα εργασία, μειώνονται σε συνθήκες υψηλής έντασης φωτισμού σε μη σιγημένα μέρη των φυτών αυτών. Σε σιγημένα μέρη των ίδιων φυτών, τα επίπεδα των πληθυσμών siRNA που προέρχονται από τη σίγηση του διαγονιδίου, εμφανίζονται μετρίως αυξημένα. Επίσης τα μεταγραφικά αποθέματα ενζύμων που συμμετέχουν στο βιοχημικό μονοπάτι της σίγησης επηρεάζονται με συγκεκριμένο τρόπο. Συγκεκριμένα η RDR6 επάγεται μεταγραφικά σε μη σιγημένους ιστούς ενώ τα mRNA της DCL3 αυξάνουν τόσο σε σιγημένους όσο και σε μη σιγημένους ιστούς. Η DCL4 παρουσιάζει ένα φωτο-εξαρτώμενο πρότυπο ακόμη και σε ιστό αγρίου τύπου. Οι φαινοτυπικές με τις μοριακές παρατηρήσεις διαφαίνεται να συνδεόνται λειτουργικά βάσει πειραμάτων αντίστροφης γενετικής. Τα αποτελέσματα από την προσέγγιση αυτή μας παραπέμπουν σε ένα υποθετικό μηχανισμό. Σύμφωνα με τα αποτελέσματα αυτά πιθανολογείται ότι η DCL3 ρυθμίζει την ένταση των σιγητικών γεγονότων ανάλογα της έντασης του φωτισμού και η DCL4 ίσως έχει καταλυτικό ρόλο στην υποδοχή του σήματος του φωτός, ρυθμίζοντας τη διαφορική απόκριση του μηχανισμού σίγησης σε συνθήκες υψηλού φωτισμού. Οι αλλαγές του μηχανισμού σίγησης οι οποίες χαρακτηρίζονται στις διαφορετικές συνθήκες φωτισμού ως προς την ένταση συσχετίζονται με την φωτο-προσαρμογή του φωτοσυνθετικού μηχανισμού στις αντίστοιχες συνθήκες. O φωτοσυνθετικός μηχανισμός διαφοροποιείται σε ιστούς στους οποίους ο μηχανισμός της RNA σίγησης είναι ενεργός. Η δομική και λειτουργική αναπροσαρμογή των θυλακοειδών μεμβρανών χλωροπλαστών σιγημένων ιστών οδηγούν σε αυξημένα επίπεδα μη φωτοχημικής απόσβεσης (NPQ) της ενέργειας και αυξημένη PSI/PSII ενεργότητα. Τα αποθέματα της πλαστοκινόνης του χλωροπλάστη, η οποία αποτελεί έναν από τους κεντρικούς αισθητήρες ως προς την αναγωγική ομοιοστασία του κυτταροπλάσματος (Scheibe et al., 2005), εμφανίζονται σημαντικά μειωμένα σε ιστούς με σίγηση. Αυτό σηματοδοτεί μία σημαντική τροποποίηση της μεταγραφικής στοιχειομετρίας των γονιδίων που κωδικοποιούν τις αποπρωτεΐνες των ενεργών κέντρων των δύο φωτοσυστημάτων (PSI & PSII) του χλωροπλάστη (Allen and Pfannschmidt, 2000). Συνέπεια αυτών των αλλαγών είναι η επαγωγή της κυκλικής ροής ηλεκτρονίων, ενός ρυθμιστικού μηχανισμού της φωτοσύνθεσης ο οποίος ενεργοποιείται προς αύξηση της παραγωγής ΑΤP (Shikanai, 2007), όταν οι ενεργειακές ανάγκες του κυττάρου το απαιτούν. Το βιοχημικό μονοπάτι του μηχανισμού της RNA σίγησης είναι ΑΤP-εξαρτώμενο (Ζamore et al., 2000). Φυτά τα οποία αναπτύσσονται σε συνθήκες υψηλής έντασης φωτισμού, έχουν μεγαλύτερα ενεργειακά (ΑΤP) αποθέματα διαθέσιμα (Walters, 2005). Οπότε είναι πιθανό ένα μέρος από αυτά τα ενεργειακά αποθέματα να σχετίζονται με τα αυξημένα γεγονότα σίγησης τα οποία παρατηρούνται σε φαινοτυπικό επίπεδο, ελέγχοντας συγχρόνως την αποτελεσματικότητα του μηχανισμού σίγησης

O ρόλος του φωτοσυνθετικού μηχανισμού στη βιοχημεία του μηχανισμού μετα-μεταγραφικής σίγησης γονιδίων στα ανώτερα φυτά.

Ο μηχανισμός της μετα-μεταγραφικής σίγησης στα φυτά αποτελεί ένα ρυθμιστικό μηχανισμό ο οποίος ρυθμίζει αρνητικά τη γονιδιακή έκφραση μέσω της αποικοδόμησης των προϊόντων της μεταγραφής με τρόπο ειδικό ως προς την νουκλεοτιδική αλληλουχία των μεταγράφων (messenger RNA, mRNA). Μία σειρά από μελέτες μαρτυρούν νύξεις ως προς την επίδραση ποικίλων οικοφυσιολογικών παραμέτρων κυρίως αβιοτικών στην επαγωγή, εξάπλωση και εδραίωση του μηχανισμού RNA σίγησης στα ανώτερα φυτά. Παρόλα αυτά, μία σχετική λεπτομερής και διεξοδική προσπάθεια συσχέτισης υπόκωφα απουσιάζει από την διεθνή βιβλιογραφία της επιστημονικής κοινότητας μέχρι σήμερα. Η φύση του παράγοντα φως πέρα από το ρόλο της στην αναπτυξιακή πτυχή των ανώτερων φυτικών οργανισμών διέπεται και από μηχανιστικές λεπτομέρειες που αφορούν αλληλεπιδραστικά την καθαυτό φυσιολογική ιδιοσυγκρασία της φωτοσυνθετικής διαδικασίας. Στη παρούσα μελέτη, επιχειρούμε να χαρακτηρίσουμε την μοριακή δομή και λειτουργία του φωτοσυνθετικού μηχανισμού ως προς αυτόν τον δεύτερο ρόλο του φωτός, αναφορικά με το μη κυτταρικά αυτόνομο μεγάλων αποστάσεων σήμα της RNA σίγησης. Για αυτό το σκοπό, in vivo μετρήσεις επαγωγικού φθορισμού της χλωροφύλλης a, ποσοτικοποίηση των χλωροφυλλών a (Chla) και b (Chlb) καθώς και in vitro εκτιμήσεις της δραστηριότητας των φωτοσυστημάτων I (PSI) και II (PSΙΙ) πραγματοποιήθηκαν σε διαγονιδιακά φυτά Nicotiana benthamiana που παράγουν αυθόρμητα το σήμα της διασυστηματικής RNA σίγησης ως προς το διαγονίδιο της Πράσινης Φθορίζουσας Πρωτεΐνης (GFP). Σε σύγκριση με φυτά αγρίου τύπου καθώς και με φυτά που εκφράζουν συστατικά το διαγονίδιο της GFP (πειράματα ελέγχου), φυτά στα οποία το σήμα της RNA σίγησης έχει εδραιωθεί, χαρακτηρίζονται από μειωμένη πυκνότητα PSII ενεργών κέντρων ενώ αντίθετα το μέγεθος της φωτοσυλλεκτικής κεραίας του LHCII (Light- Harvesting Complex II) καθώς και η μη φωτοχημική απόσβεση της ενέργειας αυξάνονται. Eπίσης ο λόγος χλωροφύλλης a/χλωροφύλλης b μειώνεται ενώ ο λόγος δραστηριότητας των φωτοσυστημάτων PSI/PSII εμφανίζεται σημαντικά αυξημένος σε ιστούς με σίγηση. Τέλος τα ανηγμένα αποθέματα της δεξαμενής της πλαστοκινόνης (PQ) σε κατάσταση παρεμπόδισης της ροής ηλεκτρονίων στo επίπεδο της QB, επαρκούν να υποστηρίξουν αποτελεσματική μεταφορά ηλεκτρονίων προς την αναγωγική πλευρά του PSI. Από τα παραπάνω απορρέουν ισχυρές ενδείξεις οι οποίες συνάγουν για κυκλική ροή ηλεκτρονίων γύρω από το PSI προς αντιστάθμιση της μειωμένης χημειωσμωτικής ικανότητας ιστών με RNA σίγηση. Τα ευρήματα μας συζητούνται λαμβάνοντας υπόψη τη βιοχημεία και λειτουργία του μηχανισμού σίγησης μέσω RNA, ενσωματώνοντας παράλληλα πιθανές προοπτικές