Τα miRNAs και γενετικοί πολυμορφισμοί ως νέοι δείκτες διάγνωσης και πρόγνωσης για το οξύ έμφραγμα του μυοκαρδίου

Τα καρδιαγγειακά νοσήματα αποτελούν την πιο συχνή αιτία θανάτων παγκοσμίως. Η σύγχρονη έρευνα στο πεδίο των καρδιαγγειακών νοσημάτων έχει ως στόχο να προτείνει βιοδείκτες διάγνωσης και/ή πρόγνωσης, οι οποίοι θα παρέχουν την ακριβή και έγκαιρη διάγνωση των ασθενειών αυτών, με στόχο την άμεση αντιμετώπισή τους, και τη μείωση του ποσοστού νοσηρότητας και θνησιμότητας στον ανθρώπινο πληθυσμό. H νέκρωση και η απόπτωση των μυοκαρδιακών κυττάρων που συμβαίνουν κατά το Οξύ Έμφραγμα του Μυοκαρδίου (ΟΕΜ), έχουν ως αποτέλεσμα ενδοκυττάρια μόρια, όπως πρωτεΐνες και ελεύθερα νουκλεΐκα οξέα (DNA/RNA), να περνούν στη κυκλοφορία του αίματος. Τα microRNAs (miRNAs-miRs) είναι μικρά μη-κωδικοποιούντα μόρια RNA, μήκους 21-23 νουκλεοτιδίων, τα οποία ρυθμίζουν τη γονιδιακή έκφραση στους ευκαρυωτικούς οργανισμούς, είτε αναστέλλοντας τη μετάφραση είτε προωθώντας την αποδόμηση συγκεκριμένων μεταγράφων RNAs (mRNAs). Τα miRs θα μπορούσαν να χρησιμοποιηθούν για την έγκαιρη διάγνωση του ΟΕΜ, καθώς εμφανίζουν μεγάλη σταθερότητα στα βιολογικά υγρά και μπορούν με ευαίσθητες τεχνικές να προσδιοριστούν ποσοτικά. Επιπλέον, το ελεύθερο εξωκυτταρικό DNA (cell free DNA-cfDNA) θα μπορούσε να αποτελέσει ευαίσθητο και αξιόπιστο δείκτη διάγνωσης του ΟΕΜ. Στους παράγοντες κινδύνου για την εκδήλωση καρδιαγγειακών νοσημάτων σημαντικό ρόλο παίζουν και γενετικοί παράγοντες. Γενετικοί πολυμορφισμοί στα γονίδια των microRNAs φαίνεται να επηρεάζουν τη λειτουργία τους και είναι πιθανόν να συμβάλουν στην εκδήλωση των πολυπαραγοντικών αυτών νοσημάτων. Σκοπός της παρούσας Διδακτορικής Διατριβής είναι η αναζήτηση νέων βιοδεικτών που θα μπορούσαν να χρησιμοποιηθούν για την έγκαιρη και ακριβή διάγνωση καρδιαγγειακών νοσημάτων, όπως είναι η Στεφανιαία Νόσος (ΣΝ) και το ΟΕΜ. Ειδικότερα, οι τρεις βασικοί στόχοι της παρούσας Διατριβής είναι: α) ο συγκριτικός ποσοτικός προσδιορισμός των επιπέδων έκφρασης των miR-208b και miR-499, τα οποία σχετίζονται με την καρδιακή λειτουργία, σε ασθενείς που έχουν υποστεί ΟΕΜ και σε υγιή άτομα του γενικού πληθυσμού, β) η εκτίμηση της δυνατότητας χρησιμοποίησης του ολικού cfDNA, που απομονώνεται από το πλάσμα ασθενών με ΟΕΜ, ως βιολογικού δείκτη για την έγκαιρη διάγνωση ΟΕΜ ασθενών και γ) η διερεύνηση των γενετικών πολυμορφισμών (SNPs) miR146a G>C (rs2910164), miR149 C>Τ (rs2292832), miR196a2 C>T (rs11614913) και miR499 A>G (rs3746444), για την πιθανή συσχέτισή τους με την εκδήλωση των ΣΝ και ΟΕΜ.Στην παρούσα μελέτη, χρησιμοποιήθηκαν δείγματα από 400 άτομα Ελληνικής καταγωγής: 200 ασθενείς με διάγνωση ΣΝ, από τους οποίους οι 80 παρουσίασαν ΟΕΜ, και 200 υγιή άτομα του γενικού πληθυσμού, τα οποία χρησιμοποιήθηκαν ως ομάδα ελέγχου. Η μεθοδολογία που ακολουθήθηκε για τον ποσοτικό προσδιορισμό των miR-208b και miR-499 ήταν η ποσοτική PCR πραγματικού χρόνου (quantitative Real-Time PCR-qPCR). Ο ποσοτικός προσδιορισμός του cfDNA έγινε με τις παρακάτω μεθόδους: 1) αντίδραση φθορισμού με το Qubit 3.0 με τη χρήση ssDNA (single strand) assay kit και dsDNA HS (double strand) assay kit, 2) φασματοφωτομετρία UV με την χρήση Nanodrop και 3) qPCR με την χρήση του TaqMan™ Copy Number Reference Assay, human, TERT. Ο ποσοτικός προσδιορισμός του cfDNA έγινε με διαφορετικές μεθοδολογίες, με σκοπό την αξιολόγησή τους όσον αφορά στην κλινική τους εφαρμογή. Η διερεύνηση του πιθανού ρόλου των γενετικών πολυμορφισμών miR146a G>C (rs2910164), miR149 C>Τ (rs2292832), miR196a2 C>T (rs11614913) και miR499 A>G (rs3746444) στην εκδήλωση καρδιαγγειακών νοσημάτων έγινε με συγκριτική μελέτη ασθενών-υγιών ατόμων (μαρτύρων). Πραγματοποιήθηκε γονοτύπιση σε ασθενείς και υγιή άτομα με τις παρακάτω μεθοδολογίες: 1) PCR-RFLP (Polymerase Chain Reaction - Restriction Fragment Length Polymorphism-Πολυμορφισμός Μήκους Περιοριστικών Θραυσμάτων), 2) Υψηλής Ευκρίνειας Ανάλυση Αποδιάταξης (High Resolution Melting Analysis - HRMA), 3) Αλληλούχιση κατά Sanger. Τα αποτελέσματα της παρούσας Διδακτορικής Διατριβής έδειξαν ότι η σχετική έκφραση των microRNAs miR-208b και miR-499 είναι δραματικά αυξημένη στους ασθενείς που έχουν υποστεί ΟΕΜ, σε σύγκριση με εκείνη που παρατηρείται στα υγιή άτομα της ομάδας ελέγχου (p<0.001). Συγκεκριμένα, τα επίπεδα των miR-208b και miR-499 στο πλάσμα αυξήθηκαν κατά 256 φορές και 675 φορές, αντίστοιχα, στους ΟΕΜ ασθενείς. Για να εκτιμηθεί η διαφοροδιαγνωστική αξία των miR-208b και miR-499 που κυκλοφορούν στο πλάσμα στη διάγνωση του ΟΕΜ υπολογίστηκε η καμπύλη ROC (ROC curve) και η περιοχή κάτω από την καμπύλη (AUC) του miR-208b είναι 0.9996 και του miR-499 είναι 0.9992. Η AUC των δύο ήδη καθιερωμένων βιοδεικτών για τη διάγνωση του ΟΕΜ, της καρδιοειδικής τροπονίνης Τ (cTnT) και του ισοενζύμου της κινάσης της κρεατίνης (CK-MB), των οποίων η αύξηση στο πλάσμα ανιχνεύεται 4 έως 6 ώρες μετά το ΟΕΜ, είναι 0.9400 και 0.9944 αντίστοιχα, αναδεικνύοντας, ως εκ τούτου, την ισχυρή διαγνωστική αξία των δύο εν λόγω microRNAs στην κλινική καρδιολογική πράξη. Η συγκέντρωση του cf-DNA στο πλάσμα των ασθενών που έχουν υποστεί ΟΕΜ ήταν σημαντικά υψηλότερη, σε σύγκριση με εκείνη των υγιών μαρτύρων (p<0.05). Η ποσοτικοποίηση, χρησιμοποιώντας το ss-DNA, έδειξε τις υψηλότερες συγκεντρώσεις cf-DNA, σε σύγκριση με εκείνες που καταγράφηκαν με το ds-DNA και το NanoDrop. Οι μετρήσεις αυτές προσεγγίζουν τις τιμές που παρατηρήθηκαν με τη μεθοδολογία qPCR, η οποία είναι ακριβής, αλλά δαπανηρή και χρονοβόρα. Τέλος, τα αποτελέσματα της παρούσας Διδακτορικής Διατριβής ανέδειξαν ότι για τους microRNA πολυμορφισμούς miR196a2 C>T (rs11614913) και miR499 A>G (rs3746444) υπάρχει στατιστικά σημαντική διαφορά στις συχνότητες γονοτύπων και αλληλομόρφων ανάμεσα στις ομάδες των ΣΝ/ΟΕΜ ασθενών και στην ομάδα ελέγχου (p<0.05). Για τους πολυμορφισμούς miR146a rs2910164G>C και miR149 rs2292832C>T δεν παρατηρήθηκε στατιστικά σημαντική διαφορά μεταξύ των ΣΝ/ΟΕΜ ασθενών και των υγιών ατόμων τόσο όσον αφορά στις συχνότητες των γονοτύπων όσο και των αλληλομόρφων (p>0.05). Η συνδυαστική μελέτη των τεσσάρων πολυμορφισμών (πρόγραμμα Haploview) έδειξε στατιστικά σημαντική διαφορά για το συνδυασμό miR-499G - miR196T - miR146C - miR149C (p=0.0487), με μεγαλύτερη συχνότητα στην ομάδα των ασθενών με διάγνωση ΣΝ. Συμπερασματικά, τα microRNAs miR-208b και miR-499 θα μπορούσαν να αποτελέσουν σημαντικούς βιοδείκτες για την έγκυρη και ακριβή διάγνωση ασθενών που έχουν υποστεί ΟΕΜ. Η χρήση τους ως βιοδεικτών για τη διάγνωση του ΟΕΜ είναι πιο ακριβής, πιο γρήγορη και έχει μικρότερο κόστος σε σχέση με τις μεθοδολογίες που χρησιμοποιούνται σήμερα. Το ελεύθερο εξωκυτταρικό DNA θα μπορούσε, επίσης, να αποτελέσει βιοδείκτη για τη διάγνωση του ΟΕΜ. Η ποσοτικοποίηση μπορεί να γίνει εύκολα και γρήγορα χρησιμοποιώντας μεθοδολογίες πιο οικονομικές σε σχέση με την qPCR. Επιπλέον, οι πολυμορφισμοί miR196a2 (rs11614913) και miR499 (rs3746444), και ο απλότυπος miR-499G-miR196T-miR146C-miR149C φαίνεται ότι αποτελούν προδιαθεσικούς παράγοντες για την εκδήλωση καρδιαγγειακών νοσημάτων στον Ελληνικό πληθυσμό. Σύμφωνα με όλα τα παραπάνω, τα αποτελέσματα της παρούσας Διδακτορικής Διατριβής, μεμονωμένα ή συνδυαστικά, αναμένεται να συμβάλουν στην πρόταση νέων βιοδεικτών για το ΟΕΜ και στη διαλεύκανση του ρόλου γενετικών πολυμορφισμών συγκεκριμένων microRNAs ως προδιαθεσικών παραγόντων για την εκδήλωση καρδιαγγειακών νοσημάτων.Cardiovascular diseases (CVD) are the most common cause of death worldwide. Current research in the field of CVD aims to explore new diagnostic and/or prognostic biomarkers for their accurate and timely diagnosis, leading to immediate treatment of those patients and reduced morbidity and mortality rates. Necrosis and apoptosis of the myocardial cells that take place during acute myocardial infarction (AMI) result in the release of intracellular molecules, such as proteins and free nucleic acids (DNA/RNA), in the bloodstream. MicroRNAs (miRNAs-miRs) are small non-coding RNA molecules, 21-23 nucleotides in length, that regulate gene expression in eukaryotic organisms, either by inhibiting translation or promoting the degradation of specific RNAs (mRNAs). MiRs could be used for the early diagnosis of AMI, as they exhibit high stability in biological fluids and can be quantified by sensitive techniques. In addition, cell free DNA (cfDNA) could also consist a sensitive and reliable diagnostic AMI marker. Genetic factors also display an essential role as risk factors for the progress of CVD. Genetic polymorphisms in microRNA genes appear to affect their function and possibly contribute to the advance of these multifactorial diseases. The goal of the present PhD thesis is to investigate novel biomarkers that could be used for the early and accurate diagnosis of CVD, such as coronary artery disease (CAD) and AMI. Specifically, the three main axes of this thesis are: a) to quantitatively compare the expression levels of miR-208b and miR-499, which are associated with the cardiac function, in AMI patients and healthy individuals of the general population, b) to estimate the role of whole cfDNA, isolated from the plasma of AMI patients, as a biological marker for the early diagnosis of their condition, and c) to investigate the genetic polymorphisms (SNPs) miR146a G>C (rs2910164), miR149 C>T (rs2292832), miR196a2 C>T (rs11614913) and miR499 A>G (rs3746444) and their potential contribution in CAD and AMI prevalence. In the current study, samples derived from 400 individuals of Greek origin were analyzed: 200 CAD patients, 80 patients diagnosed with AMI and 200 healthy people of the general population, who served as the control group. Quantitative Real-Time PCR (qPCR) was used to quantify miR-208b and miR-499. The quantification of cfDNA was performed according to the following methods: 1) fluorescence reaction with Qubit 3.0 using ssDNA (single strand) assay kit and dsDNA HS (double strand) assay kit, 2) UV spectrophotometry using Nanodrop and 3) qPCR using TaqMan™ Copy Number Reference Assay, human, TERT. The quantification of cfDNA was made using different techniques, in order to evaluate their clinical application. The examination of the potential role of miR146a G>C (rs2910164), miR149 C>T (rs2292832), miR196a2 C>T (rs11614913) and miR499 A>G (rs3746444) genetic polymorphisms in the progress of CVD required comparative analysis of patient and control groups. Genotyping of patients and healthy subjects was executed using the following methodologies: 1) PCR-RFLP (Polymerase Chain Reaction-Restriction Fragment Length Polymorphism), 2) High Resolution Melting Analysis (HRMA) and 3) Sanger sequencing. The results of this PhD thesis show that the relative expression of miR-208b and miR-499 microRNAs is dramatically increased in AMI patients compared with that observed in healthy controls (p<0.001). Specifically, in the patient group, plasma levels of miR-208b and miR-499 are augmented 256-fold and 675-fold, respectively. To evaluate the differential diagnosis of plasma circulating miR-208b and miR-499 in the diagnosis of AMI, the ROC curve is calculated. The area under the curve (AUC) of miR-208b is 0.9996 and of miR- 499 is 0.9992. The AUC of the two established biomarkers for the AMI diagnosis, cardiac troponin T (cTnT) and creatine kinase isoenzyme (CK-MB), whose plasma elevation is detected 4 to 6 hours following AMI, was 0.9400 and 0.9944, respectively; thereby highlighting the strong diagnostic value of these two microRNAs in clinical cardiology. The concentration of cf-DNA in the plasma of AMI patients was significantly higher than that of healthy controls (p<0.05). Quantification, using ss-DNA, presents the highest concentrations of cf-DNA, compared to those recorded using ds-DNA and NanoDrop. These measurements approach the values reported by the qPCR methodology, which is an accurate, but expensive and time consuming technique. Finally, the results of this PhD thesis reveal that there is a statistically significant difference in the genotypes and alleles frequencies among CAD/AMI and control groups (p<0.05) for miR196a2 C>T (rs11614913) and miR499 A>G (rs3746444) microRNA polymorphisms. For miR146a rs2910164G>C and miR149 rs2292832C> T polymorphisms, no statistically significant difference is observed among CAD/AMI patients and healthy individuals both for genotype and allele frequencies (p>0.05). The combinatorial study of the four polymorphisms (using Haploview program) indicates a statistically significant difference for the miR-499G -miR196T-miR146C-miR149C combination (p=0.0487), with a higher frequency in the group of patients diagnosed with CAD/AMI. In conclusion, miR-208b and miR-499 microRNAs could consist significant biomarkers for the valid and timely diagnosis of patients suffering from AMI. Their application as AMI biomarkers is more accurate, faster, and less expensive than the methodologies applied to date. Free extracellular DNA could also be considered as a biomarker for the diagnosis of AMI. Its quantification could be performed simply and rapidly using more cost-effective methodologies than qPCR. Moreover, miR196a2 (rs11614913) and miR499 (rs3746444) polymorphisms, and the haplotype miR-499G-miR196T-miR146C-miR149C seem to act as risk factors for CVD occurrence in the Greek population. Therefore, the results of this thesis, individually or combinatorially, are expected to contribute to the suggestion of new biomarkers for AMI and to the clarification of the role of genetic polymorphisms of specific microRNAs as risk factors for CVD

Characterization of the c.793-1G > A splicing variant in CHEK2 gene as pathogenic: a case report

BackgroundCHEK2 is involved in the DNA damage repair response Fanconi anemia (FA)-BRCA pathway. An increased risk for breast and other cancers has been documented in individuals who carry a single pathogenic CHEK2 variant. As for other genes involved in cancer predisposition, different types of pathogenic variants have been observed, including single nucleotide variations, short insertions/deletions, large genomic rearrangements and splicing variants. Splicing variants occurring in the splicing acceptor or donor site result in alternative mature mRNA produced and can cause intron retention, exon skipping, or creation of alternative 3 and 5 splice site. Thus, the pathogenicity of this type of alterations should always be explored experimentally and their effect in the mRNA and consequently the protein produced, should be defined. The aim of this study was the delineation of the effect of a splicing variant in the CHEK2 gene.Case presentation A healthy 28-year-old woman with a family history of breast and ovarian cancer was referred for genetic testing. The variant c.793-1G>A (rs730881687) was identified by Next Generation Sequencing (NGS) using a solution-based capture method, targeting 33 cancer predisposition genes (SeqCap EZ Probe library, Roche NimbleGen). Experimental analysis in patient-derived leukocytes using RT-PCR of mRNA followed by cDNA sequencing revealed the deletion of one base from the alternative transcript created (r.793del). This resulted in a frameshift leading to premature termination codon within exon 7 (p.(Asp265Thrfs*10)).Conclusions This finding suggests that the CHEK2 splicing variant c.793-1G>A is a deleterious variant. Our case shows that RNA analysis is a valuable tool for uncharacterized splice site variants in individuals referred for testing and facilitates their personalized management

Report of a germline double heterozygote in MSH2 and PALB2

Abstract Background Carriers with pathogenic variants in MSH2 have increased risk to develop colorectal, endometrium, ovarian, and other types of cancer. The PALB2 is associated with breast, ovarian, pancreatic, and prostate cancer. We describe the case of a 42‐year‐old female diagnosed with endometrial cancer at the age of 42 years with a strong family history of colorectal cancer, which was referred to our private diagnostic laboratory for genetic testing. Methods In this study, we performed next‐generation sequencing (NGS) using an amplicon based 26 genes panel. The presence of multi‐exonic copy number variations (CNVs) was investigated by computational analysis and Multiplex Ligation‐dependent Probe Amplification (MLPA). Results A gross deletion of the genomic region encompassing exons 11–16 of the MSH2 and the loss‐of‐function variant c.757_758delCT, p.(Leu253Ilefs*3) in the PALB2 were identified in the proband. Conclusions Multigene analysis using NGS technology allows the identification of pathogenic variants in genes that would normally not be tested based on the patient diagnosis. In our case these results explained not only the personal and/or family history of cancer but also allowed the surveillance for prevention of other cancer types. Moreover, the detection of large genomic rearrangements should be routinely included in hereditary cancer testing

Mutation analysis of the BRCA1 and BRCA2 genes in Turkish patients with breast cancer.

Annual Meeting of the American-Society-of-Clinical-Oncology (ASCO) / Clinical Science Symposium on Predicting and Improving Adverse Outcomes in Older Adults with Cancer -- MAY 29-JUN 02, 2015 -- Chicago, ILWOS: 000358036902345Amer Soc Clin Onco

Clinical Utility of Functional RNA Analysis for the Reclassification of Splicing Gene Variants in Hereditary Cancer

Background: Classification of splicing variants (SVs) in genes associated with hereditary cancer is often challenging. The aim of this study was to investigate the occurrence of SVs in hereditary cancer genes and the clinical utility of RNA analysis. Material and Methods: 1518 individuals were tested for cancer predisposition, using a Next Generation Sequencing ( NGS) panel of 36 genes. Splicing variant analysis was performed using RT-PCR and Sanger Sequencing. Results: In total, 34 different SVs were identified, 53% of which were classified as pathogenic or likely pathogenic. The remaining 16 variants were initially classified as Variant of Uncertain Significance (VUS). RNA analysis was performed for 3 novel variants. Conclusion: The RNA analysis assisted in the reclassification of 20% of splicing variants from VUS to pathogenic. RNA analysis is essential in the case of uncharacterized splicing variants, for proper classification and personalized management of these patients

Importance of multigene panel test in patients with consanguineous marriage and family history of breast cancer

Next-generation sequencing (NGS) technology is used to evaluate hereditary cancer risks of patients worldwide; however, information concerning the germline multigene mutational spectrum among patients with breast cancer (BC) with consanguineous marriage (CM) is limited. Therefore, this prospective study aimed to determine the molecular characteristics of patients with BC who were tested with multigene hereditary cancer predisposition NGS panel and to show the effect of CM on cancer-related genes. Patients with BC with or without CM and family history (FH) of BC treated in our breast center were selected according to The National Comprehensive Cancer Network (NCCN) criteria for hereditary BC. In these patients, the analysis of a panel of 33 genes involved in hereditary cancer predisposition was performed after genetic counseling by using NGS. The pathogenic variant (PV) and the variant of uncertain significance (VUS) were found to be 15.8 and 47.4%, respectively. PVs were identified in 10/33 genes in 34 patients; 38.2% in BRCA1/2 genes; 6, 24, and 14% in other high, moderate and low-risk genes, respectively. The CM rate was 17.7% among the 215 patients with BC. The PV rate was 13.2% in patients with CM and 16.4% in patients without CM (P=0.80). When PV and VUS were evaluated together, the PV+VUS ratio was significantly higher in patients with CM and FH of BC than patients without CM and FH of BC (88.2 vs. 63.3%, P=0.045). Analysis of multigene panel provided 9.76% additional PVs in moderate/low-risk genes. The PV rate was similar in patients with BC with or without CM. A high PV+VUS ratio in patients with CM and FH of BC suggests that genes whose importance are unknown are likely to be pathogenic genes later

Revisiting the Implications of Positive Germline Testing Results Using Multi-gene Panels in Breast Cancer Patients

Background/Aim: The use of multi-gene panels for germline testing in breast cancer enables the estimation of cancer risk and guides risk-reducing management options.The aim of this study was to present data that demonstrate the different levels of actionability for multi-gene panels used in genetic testing of breast cancer patients and their family members. Materials and Methods: We performed an analysis in our clinical database to identify breast cancer patients undergoing genetic testing. We reviewed positive results in respect of risk estimation and management, cascade family testing, secondary findings and information for treatment decision-making. Results: A total of 415 positive test reports were identified with 57.1%, 18.1%, 10.8% and 13.5% of individuals having pathogenic/likely pathogenic variants in high, moderate, low and with insufficient evidence for breast cancer risk genes, respectively. Six point seven percent of individuals were double heterozygotes. Conclusion: Germline findings in 92% of individuals are linked to evidence-based treatment information and risk estimates for predisposition to breast and/or other cancer types. The use of germline findings for treatment decision making expands the indication of genetic testing to include individuals that could benefit from targeted treatments

Revisiting the Implications of Positive Germline Testing Results Using Multi-gene Panels in Breast Cancer Patients

Background/Aim: The use of multi-gene panels for germline testing in breast cancer enables the estimation of cancer risk and guides risk-reducing management options.The aim of this study was to present data that demonstrate the different levels of actionability for multi-gene panels used in genetic testing of breast cancer patients and their family members. Materials and Methods: We performed an analysis in our clinical database to identify breast cancer patients undergoing genetic testing. We reviewed positive results in respect of risk estimation and management, cascade family testing, secondary findings and information for treatment decision-making. Results: A total of 415 positive test reports were identified with 57.1%, 18.1%, 10.8% and 13.5% of individuals having pathogenic/likely pathogenic variants in high, moderate, low and with insufficient evidence for breast cancer risk genes, respectively. Six point seven percent of individuals were double heterozygotes. Conclusion: Germline findings in 92% of individuals are linked to evidence-based treatment information and risk estimates for predisposition to breast and/or other cancer types. The use of germline findings for treatment decision making expands the indication of genetic testing to include individuals that could benefit from targeted treatments