Funktionelle und strukturelle Analyse von zellfrei produzierten Transportern und G-Protein-gekoppelten Rezeptoren : Entwicklung neuer Techniken zur schnellen und effizienten Produktion von integralen Membranproteinen

Integral membrane proteins (IMPs) account for 20-40% of all open reading frames in fully sequenced genomes and they are target of approximately 60% of all modern drugs. So far, cellular expression systems are often very insufficient for the high-level production of IMPs. Toxic effects, instability or formation of inclusion bodies are frequently observed effects that prevent the synthesis of sufficient amounts of functional protein. I have successfully established an individual cell-free (CF) expression system to overcome these IMP synthesis difficulties. The CF system was established in two different expression modes. If no hydrophobic compartment is provided, the IMPs precipitate in the reaction mixture. Interestingly, these insoluble proteins are found to differ from inclusion bodies as they readily solubilize in mild detergents and the bacterial small multi drug transporter EmrE, expressed in the insoluble mode was shown to reconstitute into liposomes in an active form. Alternatively, IMPs can be synthesized in a soluble way by supplementing the CF system with detergents. A comprehensive overview of 24 commonly used detergents was provided by analyzing their impact on the CF system as well as their ability to keep three structurally very different proteins in solution. The class of long chain polyoxyethylene-alkyl-ethers turned out to be most suitable for soluble expression of a-helical EmrE, the bacterial b-barrel type nucleoside transporter Tsx and the porcine vasopressin receptor type 2, resulting in several mg of protein per mL of reaction mixture. So far IMPs have almost completely been excluded from solution nuclear magnetic resonance (NMR) analyses. I could demonstrate that CF expression enables efficient isotopic labeling of IMPs for NMR analysis and further facilitates selective labeling strategies with combinations of 13C and 15N enriched amino acids that have not been feasible before. Four different G-protein coupled receptors (GPCRs) were successfully CF expressed in preparative scale and for the human endothelin B receptor (ETB), ligand binding ability was observed. A series of truncated ETB derivatives containing nested terminal deletions have been CF produced and functionally characterized. The core area essential for Endothelin-1 binding as well as a central region responsible for ETB oligomer formation was confined to a 39 amino acid fragment including the proposed transmembrane segment 1. The binding constant (KD) of ETB was determined to 6 nM for circular ET-1 by SPR and 29 nM for linear ET-1 by TIRFS. This data indicate a large potential of the established individual CF expression system for functional IMP synthesis.Etwa 20-40% aller Gene in Organismen codieren für integrale Membranproteine (IMPs) und es wird angenommen, dass über 60% aller Arzneimittel direkt gegen sie gerichtet sind. Diese enorme Vielfalt und Wichtigkeit steht in einem großen Widerspruch zu dem derzeitigen Wissensstand über diese Proteinklasse. Über Erfolg und Misserfolg bei funktionellen und vor allem strukturellen Untersuchungen entscheidet vorerst die Herstellung des Zielproteins. Meist aber ist die Präparation ausreichender Proteinmengen äußerst problematisch. Die Überproduktion von IMPs in zellulären Expressionssystemen wird hierbei durch die Einlagerung in die Zellmembran und den dadurch bedingten toxischen Einfluss stark behindert. Ziel dieser Arbeit war ein individuelles zellfreies Expressionsverfahren zu etablieren, mit Hilfe dessen die Herstellung und somit funktionelle und strukturelle Untersuchung von bisher problematischen IMPs ermöglicht wird. Wie in dieser Arbeit gezeigt wird, konnten auf diesem zellunabhängigen Wege verschiedenste IMPs in einem präparativen Maßstab und in einem sehr kurzen Zeitrum von 12 bis 24 Stunden hergestellt werden. Für die zellfreie Expression wurden zwei Verfahren zur Herstellung von IMPs entwickelt. Zunächst konnte gezeigt werden, dass IMPs aufgrund fehlender hydrophober Bereiche im zellfreien System unlöslich exprimiert werden. Interessanter Weise verhalten sich diese Präzipitate völlig anders als Inclusion Bodies, wie man sie aus herkömmlichen E. coli Expressionen kennt, da sie sich bereits in milden Detergenzien lösen lassen und somit keine umfangreichen Rückfaltungsprotokolle benötigt werden. Das Detergenz 1-myristoyl-2-hydroxy-sn-glycero-3-[phospho-rac-(1-glycerol)] (LMPG) wurde als generelles Mittel zum Resolubilisieren von IMPs identifiziert. Dass auf diesem neuen Wege nicht nur große Mengen sondern auch aktive IMPs hergestellt werden zeigt ein spezifischer Transport-Test des bakteriellen a-helikalen Small Multi Drug Resistenz (SMR) Transporters EmrE. Eine weitere Möglichkeit zur zellfreien Herstellung von IMPs ist die Expression in Anwesenheit von Detergenzien und somit in löslicher Form. Bei dieser zweiten Methode war jedoch anfangs zu erwarten, dass einige Detergenzien die zellfreien Expressionsbedingungen stören oder aber das IMPs nicht ausreichend solubilisieren können. Um eine umfangreiche Analyse zu gewährleisten, wurden 24 der am häufigsten für IMPs verwendeten Detergenzien sowohl auf ihre Wechselwirkung mit den Reaktionskomponenten hin untersucht, als auch auf ihre Fähigkeit, IMPs löslich zu exprimieren. Zudem wurden drei strukturell sehr unterschiedliche Proteine, EmrE, das bakterielle aus b-Faltblättern bestehende Tsx, als auch der G-Protein gekoppelte Rezeptor (GPCR) Vasopressin 2 (V2R) auf zellfrei lösliche Expression in Gegenwart dieser Detergenzien hin untersucht. Außergewöhnlich gute Ergebnisse erzielte hierbei die Gruppe von langkettigen Polyoxyethylen-Alkyl-Ethern, Brij35, Brij58, Brij78 und Brij98, die für alle drei Proteine die lösliche Expression von mehr als 1 mg pro ml Reaktionslösung ermöglichte. Zellfreie Proteinsynthese bietet einzigartige Markierungsmöglichkeiten für Proteine. Durch die gute Kontrolle aller Reaktionsbedingungen können Aminosäuren auf einfachste Weise durch isotopenparkierte Derivate ohne Expressionseinbussen und Scrambling Probleme ausgetauscht werden. In dieser Arbeit wurden diese Vorteile für die Analyse von zellfrei synthetisierten IMPs eingesetzt. GPCRs bilden die größte Gruppe von Zell-Oberflächen-Rezeptoren und sie sind an allen Signalmechanismen im menschlichen Körper beteiligt. Leider konnten GPCRs bis heute nicht in präparativen Mengen hergestellt werden, da sie große Probleme in der Expression und Aufreinigung bereiten. Diese Arbeit zeigt, dass Verschiedene GPCRs mit Hilfe des individuellen zellfreien Systems nun in großen Mengen synthetisiert werden können. Der humane Endothelin B Rezeptor (ETB) wurde in dieser Arbeit genauer untersucht. Unter Verwendung von verschieden markierten Endothelin-1 (ET-1) Liganden konnte in Koelutions-Analysen und Pull-Down Analysen die funktionelle Ligandenbindung gezeigt und die Liganden-Bindungs-Konstante (KD) mit Hilfe von Surface Plasmon Resonanz (SPR) und totaler interner Reflektions-Fluoreszenz-Spektroskopie (TIRFS) auf 6 nM bestimmt werden. Zur Untersuchung, wo ET-1 an ETB bindet wurden verschiedenen ETB Verkürzungen kloniert und zellfrei Hergestellt. Untersuchungen mit Koelutions-Analysen und Pull-Down Experimenten zeigten, dass das erste transmembran Segment maßgeblich an der Ligandenbindung von ETB beteiligt ist. Zudem wurden Dimerisierungsstudien über Pull-Down Experimente durchgeführt. Diese zeigten, dass das erste transmembran Segment ebenfalls an der Dimerisierung von ETB beteiligt ist. Diese enge Kolokalisation mit der Liganden-Bindungs-Domäne könnte durch eine spekulative dimermodulierte Ligandenbindung in ETB begründet sein. IMPs und vor allem GPCRs waren bislang von vielen biochemischen und strukturbiologischen Methoden aufgrund extremer Probleme in der Proteinpräparation nahezu ausgeschlossen. Diese Arbeit zeigt die erfolgreiche Etablierung eines individuellen zellfreien Systems zur präparativen und funktionellen IMPs Herstellung. Durch zellfreie Expression erreichbare IMPs-Mengen dieser begehrten Proteine öffnen nun neue Tore für funktionelle und strukturelle Untersuchungen