Investigação de propriedades não enzimáticas da NTPDase2

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Novas abordagens terapêuticas para glioblastoma baseadas no ensaio de resposta a terapias em culturas derivadas de pacientes

Gliomas são tumores do sistema nervoso central caracterizados por alta invasibilidade e mortalidade. Inúmeros esforços foram feitos nas últimas décadas para melhorar a sobrevida dos pacientes, porém o último marco no tratamento se deu pela implementação da temozolomida (TMZ) combinada a ressecção cirúrgica e a radioterapia (RTX) em 2005. O projeto do atlas do genoma humano do câncer (TCGA) sequenciou tumores de mais de 500 pacientes com diagnóstico de glioblastoma (GBM) e categorizou os tumores em quatro subtipos moleculares, baseados na expressão, mutações e deleções de genes. Essas alterações genéticas já foram correlacionadas à melhora na sobrevida e à sensibilidade a terapia, porém, até o momento estudos prospectivos falham em direcionar o tratamento dos pacientes baseados nas características moleculares. Em busca de melhorar o entendimento sobre a correlação entre a sensibilidade a terapia in vitro e características genotípicas e fenotípicas, nós realizamos culturas primárias de células derivadas de tumores do sistema nervoso central de 23 pacientes (24 biopsias diferentes). As células foram crescidas em DMEM/F12 suplementado com soro fetal bovino e expostas aos tratamentos em doses e tempos semelhantes aos encontrados na clínica. Foram realizadas análises de viabilidade celular sete dias após o início do tratamento para 11 culturas primárias, ou as culturas foram tratadas por cinco dias em combinação, ou não, com RTX (sem RTX: 16 culturas; com RTX: 9 culturas) seguidos de sete dias em meio livre de droga, ao fim dos quais as células remanescentes foram contadas. A radioterapia e fármacos que agem sobre o citoesqueleto (vincristina, vimblastina, paclitaxel e mebendazole) sozinhos foram os tratamentos mais eficientes em reduzir a população celular. Uma segunda rodada de tratamento com TMZ, paclitaxel e a combinação de procarbazina, CCNU e vincristina (PCV) sugere que a resistência não é estável, e sucessivas exposições ao mesmo, ou a um fármaco diferente, podem ter seus efeitos somados na diminuição do crescimento populacional ou na massa tumoral final. Ao administrar PCV e paclitaxel nas células em cultura observamos um aumento nos níveis de autofagia que correlaciona com o declínio da população. Combinações desses fármacos com concentrações plasmáticas de um bloqueador da autofagia (cloroquina) não são capazes alterar o crescimento populacional. Resultados de análises do banco disponibilizado pelo TCGA mostram que alguns pacientes não apresentam aumento na sobrevida após tratamento com TMZ, e que essa falha no tratamento correlaciona com a baixa expressão de alguns genes nos seus tumores, por exemplo, aqueles com baixa expressão de FGFR3 e AKT2. As culturas primárias e linhagens celulares com menor expressão desses genes foram sensíveis in vitro a combinação de TMZ com dois fármacos que agem sobre o citoesqueleto: vimblastina e mebendazole (TVM). Essa associação retarda o crescimento de linhagens e culturas primárias resistentes a TMZ, além de induzir parada no ciclo celular, senescência e aumento da expressão de Notch3. Devido a falha na terapia padrão, ao baixo custo e aos resultados promissores essa associação de TVM poderia ser testada em pacientes cujos tumores apresentam baixos níveis de AKT2 e FGFR3.Gliomas are tumors of the central nervous system with high invasiveness and mortality. Efforts have been done in last decades to improve patients overall survival, but the last treatment gain was given by the introduction of temozolomide (TMZ) combined with surgical resection and radiotherapy (RTX), in 2005. The cancer genome atlas (TCGA) consortion sequenced tumors from 500 patients with glioblastoma diagnosis and clustered tumors into four molecular subtypes, based on gene expression, mutations and deletions. Theses genetic alterations are associated with improved overal survival and sensitivity to therapy, but up to date, prospective studies have failed to address patients’ treatment based on molecular characteristics. In order to better understand the correlation among sensitivity in vitro and genotypic and phenotypic characteristics, we performed patient-derived cell cultures of central nervous system tumors from 23 patients (24 biopsies). Cells were grown in DMEM/F12 supplemented with fetal bovine serum and treated at doses and times similars to those administered in patients. Cell viability analyses were performed seven days after start of treatment for 11 cultures or cultures were treated for five days plus RTX (without RTX: in 16 cultures; with RTX: in 9 cultures) followed by seven day in drug-free medium, at the end, the remaining amount of cells were counted. RTX and drugs acting on cytoskeleton (vincristine, vinblastine, paclitaxel and mebendazole) alone were the most efficient treatments to reduce the population. A second round of treatment with TMZ, paclitaxel and the combination of procarbazine, CCNU and vincristine (PCV) suggests that the resistance is not stable, and repeated exposures to the same, or to another drug, could have additional effects in population or tumor mass reduction. PCV and paclitaxel treated cells showed an increase in autophagy levels correlated with reduction in population. Combining these drugs with plasmatic concentrations of an autophagy inhibitor (chloroquine) did not change population growth. Results from TCGA databank showed that some patients did not benefit in overal survival after TMZ treatment and this correlates with expression of some genes, for example, those harboring tumors with FGFR3 and AKT2 low expression. Patient-derived cultures and cell lines with low expression of these genes were sensitive in vitro to the combination of TMZ with two drugs that act on cytoskeleton: vinblastine and mebendazole (TVM). This association slowed the growth of patient-derived and cell lines tolerant to TMZ, besides inducing cell cycle arrest, senescence and increased Notch3 expression. In the case of failure of standard therapy, low cost and promising results, TVM association could be tested in patients harboring FGFR3Low/AKT2Low tumors

[Avance del boletín diario]: 1942 Diciembre 07

A NTPDase2 é uma ectonucleotidase ancorada na membrana plasmática por dois domínios transmembrana, com o sítio catalítico voltado para o meio extracelular. Sua principal função é a hidrólise de nucleotídeos trifosfatados transformando‐os em difosfatados, mais fosfato inorgânico. Em menores proporções, também é capaz de hidrolisar nucleotídeos difosfatados. Sua função é remover ATP do meio extracelular, sendo que sua ausência causa acúmulo do nucleotídeo. Trabalhos anteriores demonstram que gliomas com superexpressão da NTPDase2 passaram a apresentar características de maior malignidade e agressividade. Tais peculiaridades, geralmente, são devido a alterações nas atividades de adesão, migração e proliferação celular, processos nos quais já foi demonstrado envolvimento de outras enzimas da mesma família, como a NTPDase1 e a Ecto‐5’‐nucleotidase in vitro. O envolvimento de proteínas com domínios ATPásicos na adesão celular é antigo na literatura. Entretanto, funções da NTPDase2 nestes mecanismos celulares ainda não foram estudadas in vitro. Por isso, nesse trabalho, a NTPDase2 foi superexpressa em células U87, GL261, Cos‐7 e Hek293 a fim de se estudar seu envolvimento nos processos biológicos de adesão, migração e proliferação celular in vitro. Nossos estudos mostraram que a superexpressão de NTPDase2 não altera a proliferação nem modula a migração celular. Entretanto, sua expressão diminui de maneira geral a adesão da linhagem Hek293 transduzidas sobre matrizes extracelulares, mas não modula a adesão sobre monocamada. A análise das imagens de microscopia confocal sugere que a enzima não se concentra na superfície de contato célula‐célula, sendo que quando as células estão sobre colágeno tipo I e fibronectina há uma concentração nas regiões de membrana livre. A medida do tempo para recuperação da fluorescência após “photobleaching” indica que sobre colágeno tipo I há uma velocidade de recuperação da fluorescência maior nas regiões de membrana livre. Nossos resultados demonstram que a NTPDase2 não co‐localiza com proteínas de complexos ou de adesão focal. Assim podemos concluir que a NTPDase2 fisicamente não modula a adesão célula‐célula ou célula‐matriz.NTPDase2 is an ectonucleotidase anchored in the plasma membrane through two transmembrane domains, with the catalytic site facing the extracellular environment. Its main function is the hydrolysis of nucleotide triphosphates turning them into diphosphate nucleotides plus inorganic phosphate. To a lesser extent, it is also able to hydrolyze diphosphate nucleotides. As its function is to remove the extracellular ATP, its absence causes the accumulation of nucleotide. Previous works that reports the overexpression of NTPDase2 in gliomas shows that the cells began to exhibit features of increased malignancy and aggressiveness. Such peculiarities are usually due to changes in the activity of adhesion, migration and proliferation, processes in which it has been demonstrated involvement of other enzymes of the same family as the NTPDase1 and Ecto‐5'‐nucleotidase in vitro. The involvement of proteins with ATPase domain in adhesion is old in literature. However, functions of NTPDase2 in tumor biology have not been studied in vitro. So far, in this work, NTPDase2 was overexpressed into U87, GL261, Cos‐7 and Hek293 cells, in order to study its involvement in biological processes as adhesion, migration and cell proliferation, in vitro. Our studies show that overexpression of NTPDase2 do not alter the proliferation and do not modulate cell migration. However, its expression decreases the adhesion of transduced Hek293 cell line on extracellular matrices. Analyses of the images using a confocal microscope suggested that the enzyme do not concentrate at the cell‐cell contact surface. When the cells are cultured over collagen type I and fibronectin, there is a concentration of the protein in free membrane region. The time to fluorescence recovery after photobleaching indicates that in collagen type I there is an increased fluorescence recovery in free membrane regions. More over, our results in colocalization assay indicates that NTPDase2 is not located in focal complexes or focal adhesion. We can conclude that NTPDase2 do not physically modulate cell‐cell or cell‐matrix adhesion

Investigação de propriedades não enzimáticas da NTPDase2

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Novas abordagens terapêuticas para glioblastoma baseadas no ensaio de resposta a terapias em culturas derivadas de pacientes

Gliomas são tumores do sistema nervoso central caracterizados por alta invasibilidade e mortalidade. Inúmeros esforços foram feitos nas últimas décadas para melhorar a sobrevida dos pacientes, porém o último marco no tratamento se deu pela implementação da temozolomida (TMZ) combinada a ressecção cirúrgica e a radioterapia (RTX) em 2005. O projeto do atlas do genoma humano do câncer (TCGA) sequenciou tumores de mais de 500 pacientes com diagnóstico de glioblastoma (GBM) e categorizou os tumores em quatro subtipos moleculares, baseados na expressão, mutações e deleções de genes. Essas alterações genéticas já foram correlacionadas à melhora na sobrevida e à sensibilidade a terapia, porém, até o momento estudos prospectivos falham em direcionar o tratamento dos pacientes baseados nas características moleculares. Em busca de melhorar o entendimento sobre a correlação entre a sensibilidade a terapia in vitro e características genotípicas e fenotípicas, nós realizamos culturas primárias de células derivadas de tumores do sistema nervoso central de 23 pacientes (24 biopsias diferentes). As células foram crescidas em DMEM/F12 suplementado com soro fetal bovino e expostas aos tratamentos em doses e tempos semelhantes aos encontrados na clínica. Foram realizadas análises de viabilidade celular sete dias após o início do tratamento para 11 culturas primárias, ou as culturas foram tratadas por cinco dias em combinação, ou não, com RTX (sem RTX: 16 culturas; com RTX: 9 culturas) seguidos de sete dias em meio livre de droga, ao fim dos quais as células remanescentes foram contadas. A radioterapia e fármacos que agem sobre o citoesqueleto (vincristina, vimblastina, paclitaxel e mebendazole) sozinhos foram os tratamentos mais eficientes em reduzir a população celular. Uma segunda rodada de tratamento com TMZ, paclitaxel e a combinação de procarbazina, CCNU e vincristina (PCV) sugere que a resistência não é estável, e sucessivas exposições ao mesmo, ou a um fármaco diferente, podem ter seus efeitos somados na diminuição do crescimento populacional ou na massa tumoral final. Ao administrar PCV e paclitaxel nas células em cultura observamos um aumento nos níveis de autofagia que correlaciona com o declínio da população. Combinações desses fármacos com concentrações plasmáticas de um bloqueador da autofagia (cloroquina) não são capazes alterar o crescimento populacional. Resultados de análises do banco disponibilizado pelo TCGA mostram que alguns pacientes não apresentam aumento na sobrevida após tratamento com TMZ, e que essa falha no tratamento correlaciona com a baixa expressão de alguns genes nos seus tumores, por exemplo, aqueles com baixa expressão de FGFR3 e AKT2. As culturas primárias e linhagens celulares com menor expressão desses genes foram sensíveis in vitro a combinação de TMZ com dois fármacos que agem sobre o citoesqueleto: vimblastina e mebendazole (TVM). Essa associação retarda o crescimento de linhagens e culturas primárias resistentes a TMZ, além de induzir parada no ciclo celular, senescência e aumento da expressão de Notch3. Devido a falha na terapia padrão, ao baixo custo e aos resultados promissores essa associação de TVM poderia ser testada em pacientes cujos tumores apresentam baixos níveis de AKT2 e FGFR3.Gliomas are tumors of the central nervous system with high invasiveness and mortality. Efforts have been done in last decades to improve patients overall survival, but the last treatment gain was given by the introduction of temozolomide (TMZ) combined with surgical resection and radiotherapy (RTX), in 2005. The cancer genome atlas (TCGA) consortion sequenced tumors from 500 patients with glioblastoma diagnosis and clustered tumors into four molecular subtypes, based on gene expression, mutations and deletions. Theses genetic alterations are associated with improved overal survival and sensitivity to therapy, but up to date, prospective studies have failed to address patients’ treatment based on molecular characteristics. In order to better understand the correlation among sensitivity in vitro and genotypic and phenotypic characteristics, we performed patient-derived cell cultures of central nervous system tumors from 23 patients (24 biopsies). Cells were grown in DMEM/F12 supplemented with fetal bovine serum and treated at doses and times similars to those administered in patients. Cell viability analyses were performed seven days after start of treatment for 11 cultures or cultures were treated for five days plus RTX (without RTX: in 16 cultures; with RTX: in 9 cultures) followed by seven day in drug-free medium, at the end, the remaining amount of cells were counted. RTX and drugs acting on cytoskeleton (vincristine, vinblastine, paclitaxel and mebendazole) alone were the most efficient treatments to reduce the population. A second round of treatment with TMZ, paclitaxel and the combination of procarbazine, CCNU and vincristine (PCV) suggests that the resistance is not stable, and repeated exposures to the same, or to another drug, could have additional effects in population or tumor mass reduction. PCV and paclitaxel treated cells showed an increase in autophagy levels correlated with reduction in population. Combining these drugs with plasmatic concentrations of an autophagy inhibitor (chloroquine) did not change population growth. Results from TCGA databank showed that some patients did not benefit in overal survival after TMZ treatment and this correlates with expression of some genes, for example, those harboring tumors with FGFR3 and AKT2 low expression. Patient-derived cultures and cell lines with low expression of these genes were sensitive in vitro to the combination of TMZ with two drugs that act on cytoskeleton: vinblastine and mebendazole (TVM). This association slowed the growth of patient-derived and cell lines tolerant to TMZ, besides inducing cell cycle arrest, senescence and increased Notch3 expression. In the case of failure of standard therapy, low cost and promising results, TVM association could be tested in patients harboring FGFR3Low/AKT2Low tumors