Kipper, Franciele Cristina

Lume 5.8

A NTPDase 2 é uma ectonucleotidasetransmembrana com seu sítio catalítico voltado para o meio extracelular e tem a função de hidrolisar nucleotídeos tri em di-fosfatados, e, em menor proporção (30:1), di em mono-fosfatados.É expressa em grandes quantidades em astrócitos, porém praticamente não éexpressa em gliomas. Supõe-se que além da função de hidrólise também esteja envolvida em outras funções celulares.Adesão célula-célula: as células transduzidas com NTPDase2-EGFP foram fotografadas utilizando microscópio confocal e a quantidade de fluorescência entre as células e nas áreas de membrana livre foram mensuradas utilizando o software ImageJAdesão célula-matriz: a placa contendo astrócitos e polilisina foi preparada no dia anterior ao ensaio. As células (1 x 105) foram plaqueadassobre plástico, polilisina e matriz secretada por astrócitos. Foram utilizados astrócitos de 3 regiões distintas do cérebro: córtex (Cx), cerebelo (Ce) e hipocampo (Hi). A adesão foi mensurada pelo método do Cristal de Violeta.Ensaio de migração celular (Scratch-wound assay): um risco sob a camada de células Hek293 transduzida com NTPDase2-EGFP ou apenas com o vetor EGFP foi realizado com o auxilio de uma ponteira de 200ul. Depois as células foram lavadas para a remoção de debris e  colocadas novamente na incubadora. Em tempos pré-determinados as áreas riscadas foram analisadas e fotografadas.Wink et al. Nucleoside triphosphate diphosphohydrolase-2 (NTPDase2/CD39l1) is the dominant ectonucleotidase expressed byrat astrocytes. Neuroscience, 2006.Wink et al. Extracellular adenine nucleotides metabolism in astrocytecultures from different brain regions. Neurochem. Int., 2003.Wink et al. Altered extracellular ATP, ADP and AMP catabolism in glioma cell lines. Cancer Letters. 2003.Realizar imunohistoquímicaou imunofluorescência com anticorpos de adesão para ver co-localização com a NTPDase2.Realizar adesão em outros substratos.Tentar outras metodologias para migração.A NTPDase2 concentra-se principalmente nos pontos de adesão célula-célula (Fig.1).A enzima diminui a adesão das células em todos os substratos, incluindo aqueles onde háelevada expressão da NTPDase2 (monocamada de astrócitos) (Fig.2)Não é possível mensurar se essa enzima é capaz de alterar a capacidade de migração através do Scratch Wound Assay na linhagem Hek293 (Fig.3).INTRODUÇÃORESULTADOSMATERIAIS E MÉTODOSCONCLUSÕESPERSPECTIVASREFERÊNCIASInvestigação de propriedades não enzimáticas da NTPDase2Kipper FC1,3, Tamajusuku ASK2, Lenz G3, Wink MR11Departamento de Ciências Básicas da Saúde, UFCSPA, 2Universidade Federal do Pampa – Campus Uruguaiana, 3Departamento de Biofísica, UFRGSEmbora as células Hek293 transduzidas com NTPDase2 apresentem uma adesão diminuída aos substratos e matrizes testadas e também às células de astrócitos, cuja expressão de NTPDase2 éelevada, a microscopia confocal revela uma possível interação entre as moléculas de NTPDase2, sugerindo seu papel como uma molécula de adesão do tipo homofílicaFig.3Adesão das Heks transduzidas com NTPDase200,10,20,30,40,50,6plasticopolilisinaast Hipast Cxast Cermat Hipmat Cxmat CerAbs 570nmWtNTPDase2Figura 3: Ensaio de migração celular do tipo Scratch Wound Assay em Hek293 transduzida com EGFP fusionada ou não a NTPDase2. As fotomicrografias mostram que no decorrer do tempo não houve migração em direção ao centro de cada imagem. Houve proliferação acentuada em ambas linhagens.00,050,10,150,20,250,30,350,40,450 0,5 1 1,5 2 2,5Figura 1: A – gráfico mostrando a esquerda a concentração de EGFP no centro/2 e a direita a correlação da mesma célula na área de membrana livre. B e C – representação  das fotomicrografias com escala de intensidade.A BCFigura 2: Adesão de Hek293 e Hektransduzida com NTPDase2 sobre plástico, matriz de polilisina, monocamada de astrócitos em cultura ou matriz secretada por astrócitos de Hipocampo (Hip), Cortex(Cx) e Cerebelo (Cer). Após os tempos de 15 minutos sobre astrócitos e 30 minutos para os demais, as células não aderidas foram removidas e as aderidas foram fixadas, coradas e a absorbância lida em 570 nm.Fig.1Fig.2SUPORTE FINANCEIRO

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Investigação de propriedades não enzimáticas da NTPDase2

Universidade Federal do Rio Grande do Sul

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