Lipofectin-aided cell delivery of ribozyme targeted to human urokinase receptor mRNA

AbstractA 37-mer hammerhead ribozyme has been designed to efficiently cleave the 1.4 kb mRNA of the urokinase plasminogen activator receptor (uPAR). Under in vitro conditions, the chemically synthesized ribozyme cleaved uPAR mRNA and inhibited its translation in a concentration-dependent fashion. The ribozymes were 5′-[35S]thiophosphorylated and used as a model to analyze conditions for RNA delivery in a cultured human osteosarcoma cell system. Ribozymes degraded immediately in cell-conditioned medium but ribozymes complexed with lipofectin were protected from RNases for up to 22 h. Lipofectin rapidly transported ribozyme into the cell, where it accumulated almost exclusively in the cytoplasm. Thus, lipofectin dramatically enhances stability and cytoplasmic delivery of ribozymes, potentially enabling targeting of mRNA in vivo

Changes in Administrative Status and Urban Built Forms of the Town Centre of Berettyóújfalu After the Second World War = Változások Berettyóújfalu közigazgatási helyzetében és városközpontjának beépítési formáiban a második világháború után

After the Second World War, Hungary adopted the so-called Soviet model, which gave rise to significant changes in the state organisation. “Centralisation” and “democratic centralism” are the keywords which described the operation of government and local bodies in the four decades between 1945 and 1990. Through the change of the townscape of one settlement, this study throws light on how the change in administrative status and the centrally determined settlement policy affected urban development in Hungary, similarly to other former socialist states. Our highlighted example is Berettyóújfalu, whose administrative status changed from period to period in its 19–20th century history. Today, Berettyóújfalu’s townscape is basically determined by three architectural periods: the era of the Austro–Hungarian Monarchy (1867–1918), the period between the two world wars (1918–1944) and the age of state socialism (1949–1989). Out of these periods, the third one was the most significant, as the most important interventions into the townscape occurred at that time. It seems that in Berettyóújfalu, the appearance of urban buildings has not been brought about by economic forces, but expressly by the change in the settlement’s administrative status. It was this change that influenced the town’s architectural character, which consists of two components: the official buildings and the residential building stock. In the era of socialism, the construction of housing estates also falls into the category of public developments, as after the Second World War, the system of state organisation changed fundamentally. Local governments ceased to exist, their role was taken over by hierarchical councils. Consequently, urban policy and urban construction became central duties according to the socialist state concept. The centrally developed industry and the resulting increase in the population was served by building housing blocks with system-building technology. These panel apartment blocks occupied the urban fabric that had been an integral part of the former townscape. In this way, this changed townscape could become a kind of architectural reader on Central and Eastern European history and urban development of the 19–20th centuries. A második világháború után Magyarország átvette az úgynevezett szovjet modellt, amely jelentős változásokhoz vezetett az államszervezetben. A „központosítás” és a „demokratikus centralizmus” azok a kulcsszavak, amelyek az állami szervek, s mellettük a helyi szervek működését jellemezték az 1945 és 1990 közötti négy évtizedben. Jelen tanulmány egy település városképének változásán keresztül arra világít rá, hogy Magyarországon – hasonlóan a többi volt szocialista államhoz – miként hatott a közigazgatási státus változása és a központilag meghatározott településpolitika a városépítészetre. A mai Berettyóújfalu településképét alapvetően három építési periódus határozza meg: az Osztrák–Magyar Monarchia kora (1867–1918), a két világháború közötti időszak (1918–1944) és az államszocializmus periódusa (1949–1989). Ezek közül a legmarkánsabb a harmadik, ugyanis ekkor történtek a legjelentősebb beavatkozások a településképben. E korszakokat és a mai városképet tekintve úgy tűnik, hogy a városias épületek megjelenése Berettyóújfaluban nem a gazdasági erő hozadéka volt, hanem kifejezetten a közigazgatási helyzetének megváltozásáé. Ez befolyásolta igazán a mai építészeti karaktert, amelynek két összetevője van: egyrészt a hivatali, másrészt a lakóépület-állomány. Az államszocializmusban a lakótelepek építése is a középítkezések körébe esik, miután a második világháború után alapvetően megváltozott az államszervezet rendszere. Az önkormányzatok megszűntek, helyüket a hierarchikusan működő tanácsok vették át. Ennek velejárója volt, hogy a településpolitika, a városépítés központi feladattá vált a szocialista államfelfogásnak megfelelően. A központilag meghatározott módon telepített ipart, a hozzá kapcsolódó lakosságnövekedést házgyári lakások felépítésével szolgálták ki. Ezek a paneles lakóházak épp azt a városszövetet foglalták el, amely egyébként a maga módján szervesen illeszkedett a korábbi városképbe. Ilyen módon ez a megváltozott településkép egyfajta építészeti olvasókönyvévé vált a 19-20. század közép-kelet-európai történelmének és városépítészetének

Application of Ionic Liquids in the Utilization of the Agricultural Wastes: Towards the One-Step Pre-Treatment and Cellulose Hydrolysis

Cheap, renewable lignocellulosic materials are relevant to the future of biofuel production. Wood and agricultural wastes (e.g. straw, corn stover) provide a raw material source that cannot be used for human consumption, thus biofuels from such sources do not threaten the food supply. The aim of the work was to carry out the pre-treatment and hydrolysis of lignocellulosic material in the same ionic liquid solvent (1-n-butyl-3- methyl-imidazolium-chloride, [Bmim]Cl), using ground wheat straw and a mixture of corn (Zea mays) leaf and stover, as substrates. Our measurements show that it is possible to achieve an acceptable glucose content from the cellulose by applying Cellic® CTec2 and Cellic® HTec2 enzyme complexes

Enzyme kinetics approach to assess biocatalyst inhibition and deactivation caused by [bmim][Cl] ionic liquid during cellulose hydrolysis

The aim of this work was to study the inhibition and deactivation of commercial enzyme cocktail (Cellic® Htec2) in the presence of [bmim][Cl] ionic liquid employing model cellulosic substrate, carboxymethyl cellulose (CMC). It turned out from the experiements – relying on enzyme kinetics appproach – that [bmim][Cl] could act as a competitive inhibitor. Furthermore, depending on the process conditions i.e. contact of enzyme solution with high concentration [bmim][Cl], severe biocatalyst inactivation should be also taken into account as a potential risk during the enzymatic cellulose hydrolysis even in as short process times as few minutes

A versatile modular vector set for optimizing protein expression among bacterial, yeast, insect and mammalian hosts

We have developed a unified, versatile vector set for expression of recombinant proteins, fit for use in any bacterial, yeast, insect or mammalian cell host. The advantage of this system is its versatility at the vector level, achieved by the introduction of a novel expression cassette. This cassette contains a unified multi-cloning site, affinity tags, protease cleavable linkers, an optional secretion signal, and common restriction endonuclease sites at key positions. This way, genes of interest and all elements of the cassette can be switched freely among the vectors, using restriction digestion and ligation without the need of polymerase chain reaction (PCR). This vector set allows rapid protein expression screening of various hosts and affinity tags. The reason behind this approach was that it is difficult to predict which expression host and which affinity tag will lead to functional expression. The new system is based on four optimized and frequently used expression systems (Escherichia coli pET, the yeast Pichia pastoris, pVL and pIEx for Spodoptera frugiperda insect cells and pLEXm based mammalian systems), which were modified as described above. The resulting vector set was named pONE series. We have successfully applied the pONE vector set for expression of the following human proteins: the tumour suppressor RASSF1A and the protein kinases Aurora A and LIMK1. Finally, we used it to express the large multidomain protein, Rho-associated protein kinase 2 (ROCK2, 164 kDa) and demonstrated that the yeast Pichia pastoris reproducibly expresses the large ROCK2 kinase with identical activity to the insect cell produced counterpart. To our knowledge this is among the largest proteins ever expressed in yeast. This demonstrates that the cost-effective yeast system can match and replace the industry-standard insect cell expression system even for large and complex mammalian proteins. These experiments demonstrate the applicability of our pONE vector set

Fehérjék konformációs dinamikája mint a biomolekuláris felismerés és jelátvitel meghatározó eleme = Protein conformational dynamics as a key determinant in biomolecular recognition and signal transmission

A térszerkezet alapján, a konformációs dinamika figyelembevételével kíséreltük meg az intramolekuláris és molekulák közötti jelátvitel megértését atomi felbontással. Kísérleti objektumok: a komplement rendszer, azon belül is a nemrég felfedezett lektin út fehérjekomplexei, a flagelláris exportrendszer valamint moduláris monomer, dimer és oligomer felépítésű enzimek álltak. Megállapítottuk, hogy FliI ATPáz, amely képes az exportálandó fehérjéje kitekerésére, a FliJ, FliH és FliS komponensekkel együtt képez olyan szupramolekuláris komplexet, amely képes az export szubsztrátumok felismerésére. Leírtuk a foszfoglicerát kináz enzim alloszterikus működési mechanizmusát, atomi felbontással. Feltártuk az izopropilmalát dehidrogenáz molekuláris csuklóinak működését és szerepét az alegységek kölcsönhatásaiban. Szelektív inhibitorokkal a tankönyvi tézissel ellentétes felismerésre jutottunk, miszerint a komplement rendszer lektin útjának meghatározó aktivátora a MASP-1 szerin proteáz. Így a komplement aktiválással összefüggő betegségek új gyógyszercélpont molekuláját azonosítottuk. Felfedeztük, hogy a MASP-1 képes a kininogén hasítása útján, bradikinint felszabadítva, komplement függő gyulladást keltésére. Felfedeztük, hogy a trombinhoz hasonlóan a MASP-1, PAR-4 receptoron keresztül endotél sejteket aktivál. Bizonyítékot találtunk arra, hogy a fehérjék konformációs dinamikája meghatározza a szerkezet evolúciójának lehetséges irányait, több milliárd éves időskálán is. | The CUB2 domain of C1r without calcium has disordered structure. This flexibility, necessary for autocativation of C1r inside the C1 complex, is regulated by calcium. Using MASP-selective inhibitors we proved that, in contrast to the previous textbook picture, MASP-1 is the exclusive activator of MASP-2. Blocking the proteolytic activity of MASP-1 prevents activation of the lectin pathway, therefore MASP-1 is a new target in treating complement related diseases. We solved the structure of the catalytic region of MASP-1. The structure explains the special enzymatic characteristics of this complement protease. We discovered a new, inflammation related function of the complement system: MASP-1 is able to directly activate endothelial cells through cleaving protease activated receptor-4. We discovered that MASP-1 is able to cleave kininogen and liberates bradykinin. In this way MASP-1 can contribute to the local inflammatory reaction triggered by complement activation. The allosteric mechanismnof human PGK has been explored at atomic details. In the dimeric enzyme IPMDH structural and site-directed mutagenesis studies revealed the operation of the two main molecular hinges and their relationship with the subunit interactions. We have shown that conformational motions are linked to protein evolution by producing structural variants that can be evolutionarily stabilized. This process is exemplified by segment-swapped proteins, a new group of proteins discovered by us