10 research outputs found
Polymeric electrospun scaffolds: neuregulin encapsulation and biocompatibility studies in a model of myocardial ischemia
Cardiovascular disease represents one of the major health challenges in modern times and is
the number one cause of death globally. Thus, numerous studies are under way to identify
effective cellâ and/or growth factorâbased therapies for repairing damaged cardiac tissue. In
this regard, improving the engraftment or survival of regenerative cells and prolonging growth
factor exposure have become fundamental goals in advancing these therapeutic approaches.
Biomaterials have emerged as innovative scaffolds for the delivery of both cells and proteins in
tissue engineering applications. In the present study, electrospinning was used to generate
smooth homogenous polymeric fibers, which consisted of a PLGA/NCOâsP(EOâstatâPO)
polymer blend encapsulating the cardioactive growth factor, Neuregulinâ1 (Nrg). We evaluated
the biocompatibility and degradation of this Nrgâcontaining biomaterial in a rat model of
myocardial ischemia. Histological analysis revealed the presence of an initial acute
inflammatory response after implantation, which was followed by a chronic inflammatory
phase, characterized by the presence of giant cells. Notably, the scaffold remained in the heart
after 3 months. Furthermore, an increase in the M2:M1 macrophage ratio following
implantation suggested the induction of constructive tissue remodeling. Taken together, the
combination of Nrgâencapsulating scaffolds with cells capable of inducing cardiac regeneration
could represent an ambitious and promising therapeutic strategy for repairing diseased or
damaged myocardial tissue
Funktionelle Nanofasern fĂŒr die regenerative Medizin
This thesis concerned the design and examination of a scaffold for tissue engineering applications. The template for the presented scaffold came from nature itself: the intercellular space in tissues that provides structure and support to the cells of the respective tissue, known as extracellular matrix (ECM). Fibres are a predominant characteristic feature of ECM, providing adhesion sites for cell-matrix interactions. In this dissertation a fibrous mesh was generated using the electrospinning technique to mimic the fibrous structure of the ECM. Two base polymers were explored: a biodegradable polyester, poly(D,L-lactide-co-glycolide); and a functional PEG-based star polymer, NCO-sP(EO-stat-PO). This topic was described in three major parts: the first part was materials based, concerning the chemical design and characterisation of the polymer scaffolds; the focus was then shifted to the cellular response to this fibrous scaffold; and finally the in vivo performance of the material was preliminarily assessed. The first steps towards an electrospun mesh started with adjusting the spinning parameters for the generation of homogeneous fibres. As reported in Chapter 3 a suitable setup configuration was on the one hand comprised of a spinning solution that consisted of 28.5 w/v% PLGA RG 504 and 6 w/v% NCO-sP(EO-stat-PO) in 450 ”L acetone, 50 ”L DMSO and 10 ”L of an aqueous trifluoroacetic acid solution. On the other hand an ideal spinning behaviour was achieved at process parameters such as a flow rate of 0.5 mL/h, spinneret to collector distance of 12-16 cm and a voltage of 13 kV. The NCO-sP(EO-stat-PO) containing fibres proved to be highly hydrophilic as the functional additive was present on the fibre surface. Furthermore, the fibres featured a bulk degradation pattern as a consequence of the proportion of PLGA. Besides the morphologic similarity to ECM fibres, the functionality of the electrospun fibres is also decisive for a successful ECM mimicry. In Chapter 4, the passive as well as active functionality of the fibres was investigated. The fibres were required to be protein repellent to prevent an unspecific cell adhesion. This was proven as even 6.5 % sP(EO-stat-PO) in the PLGA fibres reduced any unspecific protein adsorption of bovine serum albumin and foetal calf serum to less than 1 %. However, avidin based proteins attached to the fibres. This adhesion process was avoided by an additional fibre surface treatment with glycidol. The active functionalisation of NCO-sP(EO-stat-PO)/PLGA fibres was investigated with two fluorescent dyes and biocytin. A threefold, chemically orthogonal, fibre modification was achieved with these dyes. The chapters about the chemical and mechanical properties laid the basis for the in vitro chapters where a specific fibre functionalisation with peptides was conducted to analyse the cell adhesion and biochemical expressions. Beginning with fibroblasts in Chapter 5 the focus was on the specific cell adhesion on the electrospun fibres. While NCO-sP(EO-stat-PO)/PLGA fibres without peptides did not allow any adhesion of fibroblasts, a fibre modification with GRGDS (an adhesion mediating peptide sequence) induced the adhesion and spreading of human dermal fibroblasts on the fibrous scaffolds. The control sequence GRGES that has no adhesion mediating qualities did not lead to any cell adhesion as observed on fibres without modifications. While the experiments of Chapter 5 were a proof-of-concept, in Chapter 6 a possible application in cartilage tissue engineering was examined. Therefore, primary human chondrocytes were seeded on fibrous scaffolds with various peptide sequences. Though the chondrocytes exhibited high viability on all scaffolds, an active interaction of cells and fibres was only found for the decorin derived sequence CGKLER. Live-cell-imaging revealed both cell attachment and migration within CGKLER-modified meshes. As chondrocytes undergo a de-differentiation towards a fibroblast-like phenotype, the chondrogenic re-differentiation on these scaffolds was investigated in a long term cell culture experiment of 28 days. Therefore, the glycosaminoglycan production was analysed as well as the mRNA expression of genes coding for collagen I and II, aggrecan and proteoglycan 4. In general only low amounts of the chondrogenic markers were measured, suggesting no chondrogenic differentiation. For conclusive evidence follow-up experiments are required that support or reject the findings. The success of an implant for tissue engineering relies not only on the response of the targeted cell type but also on the immune reaction caused by leukocytes. Hence, Chapter 7 dealt with primary human macrophages and their behaviour and phenotype on two-dimensional (2D) surfaces compared to three-dimensional (3D) fibrous substrates. It was found that the general non-adhesiveness of NCO-sP(EO-stat-PO) surfaces and fibres does not apply to macrophages. The cells aligned along the fibres on surfaces or resided in the pores of the meshes. On flat surfaces without 3D structure the macrophages showed a retarded adhesion kinetic accompanied with a high migratory activity indicating their search for a topographical feature to adhere to. Moreover, a detailed investigation of cell surface markers and chemokine signalling revealed that macrophages on 2D surfaces exhibited surface markers indicating a healing phenotype while the chemokine release suggested a pro-inflammatory phenotype. Interestingly, the opposite situation was found on 3D fibrous substrates with pro-inflammatory surface markers and pro-angiogenic cytokine release. As the immune response largely depends on cellular communication, it was concluded that the NCO-sP(EO-stat-PO)/PLGA fibres induce an adequate immune response with promising prospects to be used in a scaffold for tissue engineering. The final chapter of this thesis reports on a first in vivo study conducted with the presented electrospun fibres. Here, the fibres were combined with a polypropylene mesh for the treatment of diaphragmatic hernias in a rabbit model. Two scaffold series were described that differed in the overall surface morphology: while the fibres of Series A were incorporated into a thick gel of NCO-sP(EO-stat-PO), the scaffolds of Series B featured only a thin hydrogel layer so that the overall fibrous structure could be retained. After four months in vivo the treated defects of the diaphragm were significantly smaller and filled mainly with scar tissue. Thick granulomas occurred on scaffolds of Series A while the implants of Series B did not induce any granuloma formation. As a consequence of the generally positive outcome of this study, the constructs were enhanced with a drug release system in a follow-up project. The incorporated drug was the MMP-inhibitor Ilomastat which is intended to reduce the formation of scar tissue. In conclusion, the simple and straight forward fabrication, the threefold functionalisation possibility and general versatile applicability makes the meshes of NCO-sP(EO-stat-PO)/PLGA fibres a promising candidate to be applied in tissue engineering scaffolds in the future.Diese Dissertation beschĂ€ftigte sich mit der Entwicklung und Untersuchung eines GerĂŒsts zur Geweberegeneration. Der interzellulĂ€re Raum, der in Geweben fĂŒr die Gewebestruktur verantwortlich ist, wurde als Vorbild aus der Natur fĂŒr das entwickelte GerĂŒst verwendet. Fasern sind in dieser extrazellulĂ€ren Matrix (EZM) ein charakteristischer Bestandteil, die AdhĂ€sionssequenzen fĂŒr Zell-Matrix-Interaktionen enthalten und zur strukturellen Organisation der Gewebe beitragen. In der vorliegenden Arbeit wurden Faservliese mit Hilfe des elektrostatischen Verspinnens hergestellt, um die natĂŒrlichen Fasern der EZM zu imitieren. Zwei Polymere bildeten die chemische Grundlage fĂŒr diese Fasern: Ein bioabbaubarer Polyester, Poly(D,L-Laktid-co-Glykolid) (PLGA) und ein funktionales auf Polyethylenglykol basierendes, sternförmiges Polymer, NCO-sP(EO-stat-PO). Der erste Teil des in drei Hauptteile untergliederten Themas beschĂ€ftigte sich mit dem chemischen Design und der Fasercharakterisierung im Sinne der Materialeigenschaften. Der zweite Teil betrachtet die Auswirkungen der Fasern auf zellulĂ€rer Ebene, wĂ€hrend der dritte Teil einen ersten Eindruck ĂŒber die in vivo Reaktion auf die Materialien vermittelt. Die ersten Schritte in Richtung eines elektrostatisch gesponnenen Vlieses begannen mit der Erforschung geeigneter Einstellungen fĂŒr eine homogene Faserproduktion. Kapitel 3 thematisiert geeignete Spinnparameter, zu denen auf der einen Seite eine spinnfĂ€hige Lösung gehörte, die aus 28.5 w/v% PLGA RG 504 und 6 w/v% NCO-sP(EO-stat-PO) in 450 ”L Aceton, 50 ”L DMSO und 10 ”L trifluoressigsaurer wĂ€ssriger Lösung besteht. Auf der anderen Seite wurden Prozessparameter gefunden, wie zum Beispiel eine Flussrate von 0.5 mL/h und ein Kollektor-Abstand von 12-16 cm, die bei einer Potentialdifferenz von 13 kV ein stabiles Spinnverhalten garantierten. Fasern mit dem Additiv NCO-sP(EO-stat-PO) zeigten eine Ă€uĂerst starke Hydrophilie, da das Additiv wĂ€hrend des Spinnprozesses an die FaseroberflĂ€che segregierte. Des Weiteren sind die Fasern dank des PLGA-Anteils nach einem Volumenabbaumechanismus unter physiologischen Bedingungen degradierbar. Neben der morphologischen Ăhnlichkeit zwischen natĂŒrlichen Fasern der EZM und elektrogesponnenen Fasern ist die FunktionalitĂ€t der synthetischen Fasern entscheidend fĂŒr eine erfolgreiche Imitation der EZM. Kapitel 4 betrachtet deswegen sowohl die passive als auch aktive FunktionalitĂ€t der Fasern. Unter passive FunktionalitĂ€t fĂ€llt das proteinabweisende Verhalten, welches eine unspezifische ZelladhĂ€sion verhindert. Es wurde gezeigt, dass ein Anteil von 6.5 % sP(EO-stat-PO) in den PLGA-Fasern ausreicht, um die unspezifische AdhĂ€sion von Albumin aus Rinderserum und fötalem KĂ€lberserum auf weniger als 1 % zu senken. Dennoch adhĂ€rierten avidinbasierte Proteine auf den Fasern, was jedoch durch eine Behandlung mit Glycidol unterbunden werden konnte. Die aktive Funktionalisierung wurde exemplarisch mit zwei Fluoreszenzfarbstoffen und Biocytin untersucht. Mit diesen ModellmolekĂŒlen wurde eine dreifache, chemisch orthogonale Fasermodifizierung erreicht. Die Kapitel ĂŒber die chemischen und mechanischen Eigenschaften haben die Grundlage fĂŒr in vitro Zellversuche gelegt, bei denen eine Faserfunktionalisierung mit Peptidsequenzen durchgefĂŒhrt wurde, um eine spezifische ZelladhĂ€sion zu erreichen und die biochemische Reaktion der Zellen zu untersuchen. In Kapitel 5 lag der Fokus auf der spezifischen AdhĂ€sion von humanen dermalen Fibroblasten an den elektrogesponnenen Fasern. WĂ€hrend NCO-sP(EO-stat-PO)/PLGA Fasern ohne Peptide keine ZelladhĂ€sion zulieĂen, induzierte eine Fasermodifikation mit GRGDS, einer adhĂ€sionsvermittelnden Peptidsequenz, sowohl die AdhĂ€sion als auch Ausbreitung der Fibroblasten auf den Fasern. Eine Kontrollsequenz ohne adhĂ€sionsvermittelnde Eigenschaften (GRGES), fĂŒhrte, wie auch Fasern ohne Peptide, zu keiner ZelladhĂ€sion. Die Experimente von Kapitel 6 gingen ĂŒber das reine Machbarkeitskonzept von Kapitel 5 hinaus, indem eine mögliche Anwendung im Bereich der Knorpelregeneration untersucht wurde. Daher wurden primĂ€re humane Chondrozyten auf Faservliesen ausgesĂ€t, die mit unterschiedlichen Peptiden modifiziert wurden. Trotz einer allgemein sehr guten VitalitĂ€t der Zellen auf allen Fasertypen, zeigten die Chondrozyten nur auf Vliesen mit der aus Decorin abgeleiteten CGKLER-Sequenz eine aktive Interaktion. Diese konnte mit dem Live-Cell-Imaging-Verfahren anhand der ZelladhĂ€sion und Zellmigration beobachtet werden. Da Chondrozyten in der 2D-Expansionszellkultur einer Dedifferenzierung in Richtung eines Fibroblasten Ă€hnlichen Zelltypen unterliegen, wurde eine 28-tĂ€gige Studie durchgefĂŒhrt, um das Redifferenzierungsverhalten auf den FasergerĂŒsten zu untersuchen. Dazu wurde sowohl die Glykosaminoglykanproduktion analysiert als auch die mRNA Expression der Gene, die die Kollagen I und II, Aggrecan und Proteoglykan 4 Produktion regulieren. Die chondrogenen Marker wurden in diesen Versuchen nur geringfĂŒgig ausgeschĂŒttet, was in Anbetracht der groĂen Varianzen in den Messwerten auf keine Redifferenzierung schlieĂen lĂ€sst. FĂŒr eine abschlieĂende Beurteilung werden Folgeexperimente empfohlen, die die gemachten Beobachtungen bestĂ€rken oder widerlegen. Der Erfolg eines Implantats zur Geweberegeneration beruht nicht nur auf der gewĂŒnschten Reaktion des Zielzelltyps, sondern auch auf der Immunreaktion des Organismus, welche durch Leukozyten gesteuert wird. Folglich beschĂ€ftigte sich Kapitel 7 mit dem Verhalten und den PhĂ€notypen primĂ€rer humaner Makrophagen auf dreidimensionalen FasergerĂŒsten und zweidimensionalen OberflĂ€chen im Vergleich zueinander. Bei den Versuchen zeigte sich, dass die generelle Nicht-AdhĂ€sivitĂ€t von NCO-sP(EO-stat-PO) OberflĂ€chen fĂŒr Makrophagen nicht zutrifft. Die Zellen richteten sich an den Fasern auf den OberflĂ€chen aus oder saĂen in den Poren der Vliese. Auf flachen OberflĂ€chen ohne dreidimensionale Struktur wiesen die Makrophagen ein verzögertes AdhĂ€sionsverhalten auf und migrierten stark ĂŒber die OberflĂ€che auf der Suche nach topographischen Unebenheiten, um dort adhĂ€rent zu werden. Des Weiteren zeigte eine detaillierte Untersuchung der OberflĂ€chenmarker und der ZytokinausschĂŒttung, dass Makrophagen auf 2D-OberflĂ€chen gemÀà der OberflĂ€chenmarker einen entzĂŒndungs-hemmenden PhĂ€notypen aufwiesen, wĂ€hrend die ZytokinausschĂŒttung einen entzĂŒndungs-fördernden PhĂ€notypen suggerierte. Interessanterweise bot sich das entgegengesetzte Bild auf 3D-FaseroberflĂ€chen. Hier wurde die Erkenntnis gewonnen, dass die Morphologie einen gröĂeren Einfluss auf die Zellreaktion hat als die OberflĂ€chenchemie. Da die Immunantwort eines Organismus auf ein Implantat stark von der interzellularen Kommunikation abhĂ€ngt, wurde gefolgert, dass die NCO-sP(EO-stat-PO)/PLGA Fasern eine adĂ€quate Immunantwort hervorrufen mit vielversprechenden Aussichten, die FasergerĂŒste im Bereich der Geweberegeneration einzusetzen. Das letzte Kapitel der Dissertation berichtet ĂŒber eine erste in vivo Studie der hier vorgestellten Fasern. Mit den Fasern wurde ein bestehendes Behandlungskonzept fĂŒr Hernien des Zwerchfells erweitert und die LeistungsfĂ€higkeit in einem Kaninchenmodell ĂŒberprĂŒft. Zwei GerĂŒsttypen wurden untersucht, die sich in der OberflĂ€chenmorphologie maĂgeblich unterschieden: In Serie A wurden die elektrogesponnenen Fasern in ein Gel aus NCO-sP(EO-stat-PO) gebettet, wĂ€hrend die Fasern in Serie B nur mit einer dĂŒnnen Gelschicht bedeckt wurden, so dass die topografische Faserstruktur erhalten blieb. Nach 4 Monaten in vivo waren die behandelten Zwerchfelldefekte signifikant kleiner und ĂŒberwiegend mit Narbengewebe gefĂŒllt. Die ausgeprĂ€gte Granulombildung bei FasergerĂŒsten der Serie A konnte in der darauffolgenden Studie (Serie B) minimiert werden. Das gute Abschneiden dieser Studien wurde zum Anlass genommen, die Vliese weiterzuentwickeln und eine Medikamentenfreisetzung (Ilomastat) zu integrieren, um die Narbenbildung zu minimieren. Zusammenfassend beschreibt diese Dissertation einen einfachen und direkten Weg, Fasern fĂŒr eine gezielte Geweberegeneration zu erzeugen, die dreifach funktionalisierbar und vielseitig anwendbar sind. Dies macht FasergerĂŒste auf der Basis von NCO-sP(EO-stat-PO)/PLGA zu einem vielversprechenden Kandidaten um in der Geweberegeneration eingesetzt zu werden
An easy route to biofunctional electrospun fibres with reactive star shaped PEO-stat-PPO based molecules for tissue engineering
An easy route to biofunctional electrospun fibres with reactive star shaped PEO-stat-PPO based molecules for tissue engineering
Inducing healing-like human primary macrophage phenotypes by 3d hydrogel coated nanofibres
Biocompatibility of PLGA/sP(EO-stat-PO)-coated mesh surfaces under constant shearing stress
Influence of MMP inhibitor GM6001 loading of fibre coated polypropylene meshes on wound healing:Implications for hernia repair
Polymeric electrospun scaffolds: neuregulin encapsulation and biocompatibility studies in a model of myocardial ischemia
Cardiovascular disease represents one of the major health challenges in modern times and is
the number one cause of death globally. Thus, numerous studies are under way to identify
effective cellâ and/or growth factorâbased therapies for repairing damaged cardiac tissue. In
this regard, improving the engraftment or survival of regenerative cells and prolonging growth
factor exposure have become fundamental goals in advancing these therapeutic approaches.
Biomaterials have emerged as innovative scaffolds for the delivery of both cells and proteins in
tissue engineering applications. In the present study, electrospinning was used to generate
smooth homogenous polymeric fibers, which consisted of a PLGA/NCOâsP(EOâstatâPO)
polymer blend encapsulating the cardioactive growth factor, Neuregulinâ1 (Nrg). We evaluated
the biocompatibility and degradation of this Nrgâcontaining biomaterial in a rat model of
myocardial ischemia. Histological analysis revealed the presence of an initial acute
inflammatory response after implantation, which was followed by a chronic inflammatory
phase, characterized by the presence of giant cells. Notably, the scaffold remained in the heart
after 3 months. Furthermore, an increase in the M2:M1 macrophage ratio following
implantation suggested the induction of constructive tissue remodeling. Taken together, the
combination of Nrgâencapsulating scaffolds with cells capable of inducing cardiac regeneration
could represent an ambitious and promising therapeutic strategy for repairing diseased or
damaged myocardial tissue