Dose assessment intercomparisons within the RENEB network using G0-lymphocyte prematurely condensed chromosomes (PCC assay)

Purpose: Dose assessment intercomparisons within the RENEB network were performed for triage biodosimetry analyzing G0-lymphocyte PCC for harmonization, standardization and optimization of the PCC assay. Materials and methods: Comparative analysis among different partners for dose assessment included shipment of PCC-slides and captured images to construct dose-response curves for up to 6 Gy c-rays. Accident simulation exercises were performed to assess the suitability of the PCC assay by detecting speed of analysis and minimum number of cells required for categorization of potentially exposed individuals. Results: Calibration data based on Giemsa-stained fragments in excess of 46 PCC were obtained by different partners using galleries of PCC images for each dose-point. Mean values derived from all scores yielded a linear dose-response with approximately 4 excess-fragments/cell/Gy. To unify scoring criteria, exercises were carried out using coded PCC-slides and/or coded irradiated blood samples. Analysis of samples received 24 h post-exposure was successfully performed using Giemsa staining (1 excess-fragment/cell/Gy) or centromere/telomere FISH-staining for dicentrics. Conclusions: Dose assessments by RENEB partners using appropriate calibration curves were mostly in good agreement. The PCC assay is quick and reliable for whole- or partial-body triage biodosimetry by scoring excess-fragments or dicentrics in G0-lymphocytes. Particularly, analysis of Giemsa-stained excess PCC-fragments is simple, inexpensive and its automation could increase throughput and scoring objectivity of the PCC assay

Estimation of the absorbed dose and the risk after exposure to ionising radiation

For the evaluation and the estimation of the risk after an exposure to ionizing radiation, is necessary the estimation of the absorbed dose. The absorbed dose is estimated with physical and biological methods. The biological methods are using the chromosomal aberrations of peripheral blood lymphocytes that caused after the interaction of DNA with the ionizing radiation. The conventional biodosimetry method is based on the interpolation of the frequency of dicentrics chromosomes and rings with centromeres scored in blood lymphocytes at metaphase to a pre established dose effect calibration curve. Nevertheless, the conventional method has disadvantages: i) the analysis of dicentrics chromosomes at metaphase presupposes lymphocyte stimulation and a two day culture, failing the need for rapid estimation of the dose, ii) after exposures to very high doses, appears dicentrics saturation at the scoring analysis, that finally means sub-estimation of the absorbed dose, iii) the difficulty of the estimation of the absorbed dose after partial body exposures due to the two day lymphocyte culture and the delay of irradiated cells at the cell cycle. In the present study to overcome the shortcomings of the conventional method we induced three different more rapid, accurate and reliable approaches for the estimation of the absorbed dose after high and low exposures. At the first approach fluorescence in situ hybridization (FISH) technique with centromeric/telomeric peptide nucleid acid probes (C/T PNA) in combination with conventional dicentric analysis was used. This approach improved the precision at the analysis of dicentric and polycentric chromosomes. At the second approach a modified protocol using a short co-treatment with caffeine and colcemid before lymphocyte harvesting was used, so that the lymphocytes released from the G2 block were predominantly included in the dicentric analysis. Additional the use of FISH technique with C/T probes validated our hypothesis and enabled the identification and scoring accurately the frequency of dicentrics. The dose effect calibration curve was constructed and for higher doses without saturation. Finally at the third approach the Premature Chromosome Condensation (PCC) in blood lymphocytes by means of their fusion with Chinese Hamster Ovary (CHO) mitotic cells was used. Analysis after Giemsa staining and after FISH C/T probes was held. This method enabled the analysis of radiation induced aberrations, directly in non stimulated G0 lympocytes. The results presented that all the approaches can estimate the absorbed dose with better precision and ease when compared with the conventional biodosimetry method. However the third approach with the use of PCC method shown to be more reliable, sensitive, accurate and faster than the other approaches, especially when there is a need for a fast estimation of absorbed dose, like after a nuclear accident, where a categorization of exposed individuals is need for better medical treatment.Για την αξιολόγηση και την εκτίμηση του κινδύνου που εγκυμονεί η έκθεση σε ιοντίζουσες ακτινοβολίες είναι απαραίτητο να εκτιμηθεί η απορροφούμενη δόση. Η εκτίμηση της απορροφούμενης δόσης επιτυγχάνεται τόσο με φυσικές μεθόδους, όσο και με μεθόδους βιολογικές. Οι βιολογικές μέθοδοι που χρησιμοποιούνται εκμεταλλεύονται κυρίως τις χρωμοσωμικές αλλοιώσεις και ανακατατάξεις που προκαλούνται από την αλληλεπίδραση του γενετικού υλικού με ιοντίζουσα ακτινοβολία. Στην κλασσική κυτταρογενετική μεθοδολογία τα δικεντρικά χρωμοσώματα και οι δακτύλιοι οι οποίοι δημιουργούνται και η συχνότητα εμφάνισής τους ανά κύτταρο είναι συνάρτηση της απορροφούμενης δόσης. Χρησιμοποιώντας τις αλλοιώσεις αυτές ως δείκτη της έκθεσης, η απορροφούμενη δόση προσδιορίζεται μέσω πρότυπων καμπύλων αναφοράς. Ωστόσο, η κλασσική μέθοδος, όπως εφαρμόζεται σήμερα, εμφανίζει ορισμένα μειονεκτήματα: i) το μεγάλο χρονικό διάστημα (3 ημέρες ) που απαιτείται για τη εκτίμηση της απορροφούμενης δόσης, ii) το κορεσμό δικεντρικών χρωμοσωμάτων που παρουσιάζεται κατά την ανάλυση ύστερα από υψηλές εκθέσεις όπου έχει ως συνέπεια την υποεκτίμηση της απορροφούμενης δόσης iii) την δυσκολία στην εκτίμηση της απορροφούμενης δόσης, στην περίπτωση μη ολόσωμης έκθεσης λόγω της απαιτούμενης καλλιέργειας και της καθυστέρησης των ακτινοβολημένων λεμφοκυττάρων στον κυτταρικό κύκλο. Σκοπός της παρούσας διδακτορικής διατριβής είναι η υπέρβαση των μειονεκτημάτων της κλασσικής μεθοδολογίας χρησιμοποιώντας τρεις νέες πιο ευαίσθητες, αξιόπιστες και ακριβείς προσεγγίσεις για την ταχεία εκτίμηση της απορροφούμενης δόσης μετά από έκθεση τόσο σε χαμηλές όσο και σε υψηλές δόσεις. Στην πρώτη προσέγγιση χρησιμοποιήθηκαν ειδικοί μοριακοί ιχνηθέτες DNA για την επισήμανση των κεντρομεριδίων και των τελομεριδίων των χρωμοσωμάτων (pancentromeric and telomeric DNA probes) σε συνδυασμό με την κλασσική κυτταρογενετική μέθοδο, ώστε να βελτιωθεί η ακρίβεια ανάλυσης των δικεντρικών χρωμοσωμάτων και δακτυλίων. Στη δεύτερη προσέγγιση εφαρμόστηκε ο χημικός παράγοντας της καφεΐνης, για την άρση του G2 σημείου ελέγχου του κυτταρικού κύκλου ώστε τα κύτταρα με αυξημένο αριθμό δικεντρικών χρωμοσωμάτων να μπορέσουν να απεγκλωβιστούν από τη G2 φάση και να φθάσουν στη μετάφαση για ανάλυση. Επιπλέον, με την προσθήκη και ειδικών μοριακών ιχνηθετών DNA για την επισήμανση των κεντρομεριδίων και των τελομεριδίων των χρωμοσωμάτων, επιτεύχθηκε η απευθείας παρατήρηση και ποσοτικοποίηση με ακρίβεια του αυξημένου αριθμού δικεντρικών χρωμοσωμάτων και δακτυλίων στα λεμφοκύτταρα, τα οποία μόλις απελευθερώθηκαν από το G2 σημείου ελέγχου. Κατασκευάστηκε επομένως καμπύλη αναφοράς απορροφούμενης δόσης-απόκρισης χωρίς την εμφάνιση κορεσμού ακόμη και στις υψηλές δόσεις. Τέλος στη τρίτη προσέγγιση χρησιμοποιήθηκε η Μέθοδος της Πρόωρης Χρωμοσωματικής Συμπύκνωσης (Premature Chromosome Condensation - PCC) των λεμφοκυττάρων του περιφερικού αίματος που επάγεται μέσω της σύντηξης των λεμφοκυττάρων με μιτωτικά κύτταρα Chinese Hamster Ovary (CHO) ώστε η εκτίμηση των απορροφούμενων δόσεων να γίνεται πλέον σε τρεις ώρες αντί των τριών ημερών που απαιτούνται με την κλασσική κυτταρογενετική μεθοδολογία. Η ανάλυση έγινε με απλή χρώση Giemsa καθώς και με τη χρήση ειδικών μοριακών ιχνηθετών DNA για την επισήμανση των κεντρομεριδίων και των τελομεριδίων των χρωμοσωμάτων. Τα αποτελέσματα έδειξαν ότι και με τις τρείς προσεγγίσεις η εκτίμηση της απορροφούμενης δόσης γίνεται με μεγαλύτερη ευκολία και ακρίβεια σε σχέση με την κλασσική κυτταρογενετική μεθοδολογία. Ωστόσο, η μέθοδος της Πρόωρης Χρωμοσωματικής Συμπύκνωσης και η περαιτέρω ανάπτυξή της εμφανίζεται ως η πλέον υποσχόμενη προσέγγιση όταν η ταχεία εκτίμηση της απορροφούμενης δόσης είναι απαραίτητη, όπως σε περιπτώσεις ατυχήματος και έκθεσης πολλών μελών του πληθυσμού, όπου η ταξινόμηση τους σε ομάδες διαφορετικής επικινδυνότητας είναι αναγκαία ώστε να τους παρασχεθεί η βέλτιστη ιατρική περίθαλψη και παρακολούθησή τους

Μελέτη ευχρηστίας υπηρεσιών ηλεκτρονικής διακυβέρνησης: η περίπτωση των πολιτών 55-70 ετών.

Δεκαεπτά μεγαλύτεροι ενήλικες κλήθηκαν να φέρουν εις πέρας δύο έργα από ιστοσελίδα υπηρεσίας κοινής ωφέλειας. Υπολογίστηκε ο χρόνος εκτέλεσης κι η αναλογία επιτυχίας κι αποτυχίας για κάθε στάδιο εκτέλεσης. Επιπλέον, καταγράφηκαν ως ποιοτικές μεταβλητές οι λεκτικοποιήσεις των συμμετεχόντων κατά την εκτέλεση, τα λάθη τους, καθώς και οι εκ των υστέρων επεξηγήσεις τους σχετικά με αυτά. Τα ποιοτικά δεδομένα αναλύθηκαν με τη μέθοδο της Θεματικής Ανάλυσης. H μελέτη κατέληξε σε συμπεράσματα σχετικά με τη χρήση συστημάτων από τη συγκεκριμένη ηλικιακή ομάδα, καθώς και προτάσεις ανασχεδιασμού.Two tasks were performed by 17 Greek older adults using an e-government webpage, while voice and mouse movement were being recorded. The collected data were qualitative and quantitative in nature. More precisely, we collected and analyzed completion time for each stage of each task, success rate, and number of errors occurred. Moreover utterances produced during the execution were analyzed using the Thematic Qualitative Analysis methodology in order to conclude to distinct categories, and then analyze them quantitatively. The errors were processed and analyzed using the same methodology and we made an attempt to estimate the mental models that generated them. The scope of this study was to document the pitfalls the active older adults face during completing their tasks in digital citizen services, and possibly hopefully to design thinking

Εκτίμηση απορροφουμένης δόσης και εξατομίκευση επικινδυνότητας της έκθεσης σε ιοντίζουσες ακτινοβολίες βάσει των επαγόμενων χρωμοσωματικών αλλοιώσεων σε λεμφοκύτταρα περιφερικού αίματος

Για την αξιολόγηση και την εκτίμηση του κινδύνου που εγκυμονεί η έκθεση σε ιοντίζουσες ακτινοβολίες είναι απαραίτητο να εκτιμηθεί η απορροφούμενη δόση. Η εκτίμηση της απορροφούμενης δόσης επιτυγχάνεται τόσο με φυσικές μεθόδους, όσο και με μεθόδους βιολογικές. Οι βιολογικές μέθοδοι που χρησιμοποιούνται εκμεταλλεύονται κυρίως τις χρωμοσωμικές αλλοιώσεις και ανακατατάξεις που προκαλούνται από την αλληλεπίδραση του γενετικού υλικού με ιοντίζουσα ακτινοβολία. Στην κλασσική κυτταρογενετική μεθοδολογία τα δικεντρικά χρωμοσώματα και οι δακτύλιοι οι οποίοι δημιουργούνται και η συχνότητα εμφάνισής τους ανά κύτταρο είναι συνάρτηση της απορροφούμενης δόσης. Χρησιμοποιώντας τις αλλοιώσεις αυτές ως δείκτη της έκθεσης, η απορροφούμενη δόση προσδιορίζεται μέσω πρότυπων καμπύλων αναφοράς. Ωστόσο, η κλασσική μέθοδος, όπως εφαρμόζεται σήμερα, εμφανίζει ορισμένα μειονεκτήματα: i) το μεγάλο χρονικό διάστημα (3 ημέρες ) που απαιτείται για τη εκτίμηση της απορροφούμενης δόσης, ii) το κορεσμό δικεντρικών χρωμοσωμάτων που παρουσιάζεται κατά την ανάλυση ύστερα από υψηλές εκθέσεις όπου έχει ως συνέπεια την υποεκτίμηση της απορροφούμενης δόσης iii) την δυσκολία στην εκτίμηση της απορροφούμενης δόσης, στην περίπτωση μη ολόσωμης έκθεσης λόγω της απαιτούμενης καλλιέργειας και της καθυστέρησης των ακτινοβολημένων λεμφοκυττάρων στον κυτταρικό κύκλο. Σκοπός της παρούσας διδακτορικής διατριβής είναι η υπέρβαση των μειονεκτημάτων της κλασσικής μεθοδολογίας χρησιμοποιώντας τρεις νέες πιο ευαίσθητες, αξιόπιστες και ακριβείς προσεγγίσεις για την ταχεία εκτίμηση της απορροφούμενης δόσης μετά από έκθεση τόσο σε χαμηλές όσο και σε υψηλές δόσεις. Στην πρώτη προσέγγιση χρησιμοποιήθηκαν ειδικοί μοριακοί ιχνηθέτες DNA για την επισήμανση των κεντρομεριδίων και των τελομεριδίων των χρωμοσωμάτων (pancentromeric and telomeric DNA probes) σε συνδυασμό με την κλασσική κυτταρογενετική μέθοδο, ώστε να βελτιωθεί η ακρίβεια ανάλυσης των δικεντρικών χρωμοσωμάτων και δακτυλίων. Στη δεύτερη προσέγγιση εφαρμόστηκε ο χημικός παράγοντας της καφεΐνης, για την άρση του G2 σημείου ελέγχου του κυτταρικού κύκλου ώστε τα κύτταρα με αυξημένο αριθμό δικεντρικών χρωμοσωμάτων να μπορέσουν να απεγκλωβιστούν από τη G2 φάση και να φθάσουν στη μετάφαση για ανάλυση. Επιπλέον, με την προσθήκη και ειδικών μοριακών ιχνηθετών DNA για την επισήμανση των κεντρομεριδίων και των τελομεριδίων των χρωμοσωμάτων, επιτεύχθηκε η απευθείας παρατήρηση και ποσοτικοποίηση με ακρίβεια του αυξημένου αριθμού δικεντρικών χρωμοσωμάτων και δακτυλίων στα λεμφοκύτταρα, τα οποία μόλις απελευθερώθηκαν από το G2 σημείου ελέγχου. Κατασκευάστηκε επομένως καμπύλη αναφοράς απορροφούμενης δόσης-απόκρισης χωρίς την εμφάνιση κορεσμού ακόμη και στις υψηλές δόσεις. Τέλος στη τρίτη προσέγγιση χρησιμοποιήθηκε η Μέθοδος της Πρόωρης Χρωμοσωματικής Συμπύκνωσης (Premature Chromosome Condensation - PCC) των λεμφοκυττάρων του περιφερικού αίματος που επάγεται μέσω της σύντηξης των λεμφοκυττάρων με μιτωτικά κύτταρα Chinese Hamster Ovary (CHO) ώστε η εκτίμηση των απορροφούμενων δόσεων να γίνεται πλέον σε τρεις ώρες αντί των τριών ημερών που απαιτούνται με την κλασσική κυτταρογενετική μεθοδολογία. Η ανάλυση έγινε με απλή χρώση Giemsa καθώς και με τη χρήση ειδικών μοριακών ιχνηθετών DNA για την επισήμανση των κεντρομεριδίων και των τελομεριδίων των χρωμοσωμάτων. Τα αποτελέσματα έδειξαν ότι και με τις τρείς προσεγγίσεις η εκτίμηση της απορροφούμενης δόσης γίνεται με μεγαλύτερη ευκολία και ακρίβεια σε σχέση με την κλασσική κυτταρογενετική μεθοδολογία. Ωστόσο, η μέθοδος της Πρόωρης Χρωμοσωματικής Συμπύκνωσης και η περαιτέρω ανάπτυξή της εμφανίζεται ως η πλέον υποσχόμενη προσέγγιση όταν η ταχεία εκτίμηση της απορροφούμενης δόσης είναι απαραίτητη, όπως σε περιπτώσεις ατυχήματος και έκθεσης πολλών μελών του πληθυσμού, όπου η ταξινόμηση τους σε ομάδες διαφορετικής επικινδυνότητας είναι αναγκαία ώστε να τους παρασχεθεί η βέλτιστη ιατρική περίθαλψη και παρακολούθησή τους.For the evaluation and the estimation of the risk after an exposure to ionizing radiation, is necessary the estimation of the absorbed dose. The absorbed dose is estimated with physical and biological methods. The biological methods are using the chromosomal aberrations of peripheral blood lymphocytes that caused after the interaction of DNA with the ionizing radiation. The conventional biodosimetry method is based on the interpolation of the frequency of dicentrics chromosomes and rings with centromeres scored in blood lymphocytes at metaphase to a pre established dose effect calibration curve. Nevertheless, the conventional method has disadvantages: i) the analysis of dicentrics chromosomes at metaphase presupposes lymphocyte stimulation and a two day culture, failing the need for rapid estimation of the dose, ii) after exposures to very high doses, appears dicentrics saturation at the scoring analysis, that finally means sub-estimation of the absorbed dose, iii) the difficulty of the estimation of the absorbed dose after partial body exposures due to the two day lymphocyte culture and the delay of irradiated cells at the cell cycle. In the present study to overcome the shortcomings of the conventional method we induced three different more rapid, accurate and reliable approaches for the estimation of the absorbed dose after high and low exposures. At the first approach fluorescence in situ hybridization (FISH) technique with centromeric/telomeric peptide nucleid acid probes (C/T PNA) in combination with conventional dicentric analysis was used. This approach improved the precision at the analysis of dicentric and polycentric chromosomes. At the second approach a modified protocol using a short co-treatment with caffeine and colcemid before lymphocyte harvesting was used, so that the lymphocytes released from the G2 block were predominantly included in the dicentric analysis. Additional the use of FISH technique with C/T probes validated our hypothesis and enabled the identification and scoring accurately the frequency of dicentrics. The dose effect calibration curve was constructed and for higher doses without saturation. Finally at the third approach the Premature Chromosome Condensation (PCC) in blood lymphocytes by means of their fusion with Chinese Hamster Ovary (CHO) mitotic cells was used. Analysis after Giemsa staining and after FISH C/T probes was held. This method enabled the analysis of radiation induced aberrations, directly in non stimulated G0 lympocytes. The results presented that all the approaches can estimate the absorbed dose with better precision and ease when compared with the conventional biodosimetry method. However the third approach with the use of PCC method shown to be more reliable, sensitive, accurate and faster than the other approaches, especially when there is a need for a fast estimation of absorbed dose, like after a nuclear accident, where a categorization of exposed individuals is need for better medical treatment

Interphase Cytogenetic Analysis of Micronucleated and Multinucleated Cells Supports the Premature Chromosome Condensation Hypothesis as the Mechanistic Origin of Chromothripsis

The discovery of chromothripsis in cancer genomes challenges the long-standing concept of carcinogenesis as the result of progressive genetic events. Despite recent advances in describing chromothripsis, its mechanistic origin remains elusive. The prevailing conception is that it arises from a massive accumulation of fragmented DNA inside micronuclei (MN), whose defective nuclear envelope ruptures or leads to aberrant DNA replication, before main nuclei enter mitosis. An alternative hypothesis is that the premature chromosome condensation (PCC) dynamics in asynchronous micronucleated cells underlie chromosome shattering in a single catastrophic event, a hallmark of chromothripsis. Specifically, when main nuclei enter mitosis, premature chromatin condensation provokes the shattering of chromosomes entrapped inside MN, if they are still undergoing DNA replication. To test this hypothesis, the agent RO-3306, a selective ATP-competitive inhibitor of CDK1 that promotes cell cycle arrest at the G2/M boundary, was used in this study to control the degree of cell cycle asynchrony between main nuclei and MN. By delaying the entrance of main nuclei into mitosis, additional time was allowed for the completion of DNA replication and duplication of chromosomes inside MN. We performed interphase cytogenetic analysis using asynchronous micronucleated cells generated by exposure of human lymphocytes to γ-rays, and heterophasic multinucleated Chinese hamster ovary (CHO) cells generated by cell fusion procedures. Our results demonstrate that the PCC dynamics during asynchronous mitosis in micronucleated or multinucleated cells are an important determinant of chromosome shattering and may underlie the mechanistic origin of chromothripsis