A természet szénhidrátkémikusai: enzimatikus glikozilezések = Nature's carbohydrate chemists: enzymatic glycosylation

Oligoszacharidok enzimekkel történő előállítása egy igen vonzó alternatív módszer a konvencionális kémiai megközelítés mellett, mert védő csoportok használata nélkül a célvegyület képződését eredményezi. Ezen pályázatban az anomer konfigurációt megtartó alpha amilázok transzglikozilezési képességét tanulmányoztuk humán amiláz szubsztrátok és inhibitorok előállítására. Az akarviozinil-izomaltozil- spiro-tiohidantoin szintézisét a Bacillus stearothermophilus maltogén amilázával (BSMA) oldottuk meg. A BSMA enzim az akarbóz pszeudotriszacharid részét a glüko-spiro-tiohodantoin (GTH) akceptorra transzferálta. A PTS-GTH szerkezetvizsgálata azt mutatta, hogy a glikozilezés főként a glükóz 6-os OH-ján történt az anomer konfiguráció megtartásával. Az akarbózzal meghoszabbított termék több nagyságrenddel hatékonyabb inhibitora a humán amiláznak, mint a kis méretű GTH molekula. A humán amiláz nem rendelkezik transzferáz aktivitással, de mutációval sikerült transzglikozilezési képességet ?bevezetni? a vad típusú enzimbe. A Tyr151Met mutánssal kromoforral jelzett maltooligoszacharidokat állítottunk elő és a PNP 1-tio-béta-maltooligoszacharidokat DP 2-4 izoláltuk. A Tyr151Met mutáns maltotetraóz donorról maltóz és maltotrióz egységeket transzferált különböző PNP glikozidokra. Az NMR analízisek szerint a mutáns enzim megőrízte sztereo-és regioszelektivitását. A glikozilezés a glikozil akceptor 4-es OH-ján történt.Jelenleg árpa amiláz mutánsokkal történő szintézisek folynak. | Enzyme-catalyzed synthesis of oligosaccharides allows the formation of well-defined oligosaccharides selectively without using any protection of hydroxyl groups. In this project the application of transglycosylation ability of retaining glycosidases was studied for the synthesis of oligosaccharide substrates and inhibitors of human amylases. Synthesis of acarviosinyl-isomaltosyl-spiro-thiohydantoin has been achieved by Bacillus stearothermophilus maltogenic amylase (BSMA). BSMA was capable of transferring the acarviosine-glucose residue from an acarbose donor onto glucopyranosylidene-spiro-thiohydantoin (GTH). Structural studies revealed that the enzyme reserved its stereoselectivity. Glycosylation took place mainly at C-6 position. The isolated compound was found to be a much more efficient salivary amylase inhibitor than GTH with kinetic constants of KEI=0.19 uM and KESI= 0.24 uM. Transglycosylation activity has been introduced into human salivary alpha amylase by genetic engineering. Synthesis of PNP 1-thio beta-maltooligosaccharides DP 2-4 has been carried out by a Tyr151Met mutant of HSA. Tyr151Met was capable of transferring maltose and maltotriose residues from a maltotetraose donor onto different PNP glycosides. NMR studies revealed that the mutated enzyme preserved the stereo- and regioselectivity. The glycosylation took place at position 4 of the glycosyl acceptor, exclusively. Nowadays transferase activity of barley amylase mutants has also been studied

Mapping of barley α-amylases and outer subsite mutants reveals dynamic high-affinity subsites and barriers in the long substrate binding cleft

AbstractSubsite affinity maps of long substrate binding clefts in barley α-amylases, obtained using a series of maltooligosaccharides of degree of polymerization of 3–12, revealed unfavorable binding energies at the internal subsites −3 and −5 and at subsites −8 and +3/+4 defining these subsites as binding barriers. Barley α-amylase 1 mutants Y105A and T212Y at subsite −6 and +4 resulted in release or anchoring of bound substrate, thus modifying the affinities of other high-affinity subsites (−2 and +2) and barriers. The double mutant Y105A-T212Y displayed a hybrid subsite affinity profile, converting barriers to binding areas. These findings highlight the dynamic binding energy distribution and the versatility of long maltooligosaccharide derivatives in mapping extended binding clefts in α-amylases

Inhibition studies on α-amylase using isothermal titration calorimetry

L

Kutatások a MALDI-TOF tömegspektrometria szénhidrátkémia alkalmazási lehetőségeinek kiszélesítésére = Investigation of widening of the MALDI-TOF MS applications in carbohydrate chemistry

A kutatás fő célkitűzése volt szénhidrátok és származékaik (védőcsoportokat tartalmazó vagy fehérjéhez kötött oligoszacharidok) MALDI-TOF tömegspektrometriás meghatározásához optimális kísérleti körülmények megállapítása és így a szénhidrátkémiai kutatások segítése. Ciklodextrin modellvegyületek alkalmazásával vizsgáltuk a minta előkészítés és felvitel valamint a kísérleti paraméterek változtatásának hatását a spektrumra. Tanulmányozzuk a mátrix anyagának, a minta koncentrációjának, a mintafelvitel módjának és a reflektron detektor érzékenység hatását a spektrum minőségére. Védőcsoportokat tartalmazó oligoszacharidok mérésekor számos törvényszerűséget figyeltünk meg a védőcsoportok stabilitása, a különböző mátrixok és kísérleti paraméterek között. A MALDI mérések segítették a termékek és melléktermékek azonosítását kémiai és enzimes oligoszacharid szintézisek esetében. Fragmentációs vizsgálatokkal kémiai és enzimatikus szintézissel előállított oligoszacharidok, valamint természetes eredetű amiláz inhibítorok szerkezet felderítését végeztük el. Meghatároztuk különböző neoglikoproteinek oligoszacharid tartalmát, amely meghatározó a sikeres immunválasz kiváltásában. Méréseinkkel támogattuk a különböző neoglikoprotein előállítási módszerek szisztematikus vizsgálatát. | The object of this research program was the application of MALDI-TOF MS in the field of carbohydrates and glycoconjugates. Cyclodextrins as model compounds were used to investigate the effect of the sample preparation methods and experimental parameters on the spectrum. The studied experimental parameters were: different matrix compounds, detector sensitivity, sample concentration and sample preparation methods. The stability of the protecting groups under the conditions of the evaporation/ionization was studied. The MALDI measurements assisted to identify products and byproducts of different chemical and enzymatic oligosaccharide syntheses (eg. sugar-sulfonates, sulfonic acid esters, PNP-glycosides and acarbose derivatives). Structural analysis and verification were made using post source decay fragmentation method in case of a tetrasaccharid component of N-glycanes, acarbose and its derivatives obtained by enzymatic synthesis and some natural alpha-amylase inhibitors. In addition we used this method for determination of molecular masses of neoglycoproteins

Szénhidrátok szulfonsav származékainak szintézise és biológiai hatásuk vizsgálata = Synthesis and biological studies of sulfonic acid derivatives of carbohydrates

A biológiai szabályozási folyamatok negatív töltésű szénhidrátjai uronsavakat, szulfátészter csoportokat vagy N-acetil-neuraminsavat tartalmaznak. Célunk a cukorvázon szulfonsavat vagy metilénszulfonsavat hordozó analógok előállítása volt. Potenciálisan antiadhéziós és antimetaszatikus di- és triszacharid-szulfonsavakat szintetizáltunk anomer pozícióban szulfonometil elágazást tartalmazó tioglikozid-donorokkal. A tioglikozidokból glikozilezéskor lejátszódó eliminációs mellékreakció visszaszorítására fluorid-, klorid- és bromid-donorokat preparáltunk az 1-etoxiszulfonilmetil-heptulózokból és megvizsgáltuk glikozilezési tulajdonságaikat. A leghatékonyabbnak bizonyult glikozil kloridok felhasználásával cukoregységenként egy szulfonsavcsoportot tartalmazó, tetraszacharidig terjedő maltooligomer-típusú oligoszacharid sorozatokat állítottunk elő, esetükben heparin-analóg, és amiláz inhibitor hatás várható. L-Fukózból előállítottuk az N-acetilneuraminsav szulfonsav anlogonjait, neuraminidázgátló hatásukat bakteriális eredetű neuraminidázokon teszteltük Glikozidok 2-, 3- és 4-helyzetű exometilén csoportjain gyökös tioladdíciót követő oxidációval és szulfitaddícióval mikobaktériumok felületi antigénjében előforduló cukorszulfátészter mimetikumokat preparáltunk. Tioglikozidok 2-mezil/tozil származékaiból O-, S- és azid-nukleofilekkel glükozid és mannozid C-2-szulfonsavakat állítottunk elő. | Carbohydrates of recognition processes contain uronic acids, sulfate esters or NAc neuraminic acid. Our goal was the synthesis of carbohydrate mimetics with sulfonic acid or methylenesulfonic acid moiety. Potentially antiadhesive and antimetastatic di- and trisaccharides were prepared using 1-ethoxysulfonylmethyl thioglycoside donors, one of the compound had moderate antimetastatic activity. To avoid the elimination side reaction occuring at glycosylation with the thioglycosides we prepared glycosyl fluorides, chlorides and bromides from 1-ethoxysulfonylmethyl heptuloses and studied their glycosylation activity. Using the most effective glycosyl chlorides we synthesized oligosaccharide analogs up to tetrasaccharides bearing one sulfonic acid moiety per monomeric unit. These are expected to have anticoagulant or amylase inhibitory activities. Starting from L-fucose we prepared sulfonic acid analogs of NAc neuraminic acid and their neuraminidase inhibitory activity were tested on bacterial enzymes. Mimetics of sugar sulfate esters of mycobacterial surface antigens were synthesized by means of radical thiol addition and subsequent oxidation or sulfite ion addition onto exomethylene groups of glycosides. The reaction of 2-mesyl/tosyl esters of thioglycosides with O-, S- and azide nucleophiles C-2 sulfonic acids with D-gluco and manno configuration were obtained

Szénhidrát alapú C- és CH2-szulfonsavak szintézise és biológiai vizsgálata, továbbá cukorszulfopeptidek előállítása = Synthesis and biological investigation of carbohydrate containing C- and CH2- sulfonic and that of the sugar sulfopeptides

Ötéves célkitűzésünk alatt 16 nemzetközi közleményt publikáltunk. Mindenekelőtt a szénhidrátszulfonsavak előállításának különböző lehetőségeit vizsgáltuk. Eredményesen valósítottuk meg az intra- és intermolekuláris nukleofil reakciókat. Legfontosabb célkitűzésünk, a a cukorszulfonsavak előállítására alkalmas reakciók vizsgálata, pl. az 1-tio-2-O-mezil-beta-D-glükozidok és 1-tio-2-O-mezil-alfa-D-mannozidok transzformációja 1,2-transz-D-manno- ill. glükopiranoziddá. Kiemelhető az exo-metilén csoport bevezetése és szulfonometil-csoporttá alakítása szulfit addícióval. Az izolált vegyületek konfigurációjának és konformációjának meghatározása 1H- és 13C-NMR segítségével, ill. oldat és szilárd fázisú chiroptikai módszerrel történt. Az N-acetilneuraminsav analógok szinétzisét L-fukózból kiindulva valósítottuk meg. A vegyület gyűrű-rendszere biológiai aktivitást mutat. A vegyületek hiányzó anomer protona következtében távolható NMR mérések és molekuláris számítások (QM) elengedhetetlenül szükségesek voltak. Magasabb tagszámú 3,6 elágazású arabinogalaktán oligoszacharidok (tetra és hexa) előállítását megvalósítottuk. A Mycobacterium avium 19-es szerovariáns sejtfelszíni pentaszacharidjának szintézisét a közelmúltban valósítottuk meg. A legvonzóbb eredmény a szulfonsavtartalmú heparinoid mono- és oligoszacharidok szintézise. Valamennyi építőelem alkalmas védőcsoportként kezelhető. Jelenleg 6 diszacharid egység a közeli jövőben pentaszacharidig teljesíthető. | As a result of our OTKA project, aimed, primarily, at the investigation of the possibilities for the preparation carbohydrate sulfonic acids, 16 papers were published in international journals. We realized the transformation of 1-thio-2-O-mesyl-beta-D-glucopyranosides and 1-thio-2-O-mesyl-alpha-D-mannopyranosides into 1,2-trans-D-manno- and glucopyranosides. An important result is the introduction of the exo-methylene group and its conversion into sulfonatomethyl moiety by sulfit addition. The determination of the configuration and conformation of the isolated compounds was carried out with NMR techniques, as well as by means of solution- and solid-phase chiroptical methods. The N-acetylneuraminic acid analogues were synthesized from L-fucose. The prepared compounds, carrying the demanded ring-system, showed biological activity. Due to the missing anomeric proton of such ketoses, long-range NMR coupling measurements and molecular calculatios (QM) were established. Our research group performed the preparation of 3.6-branched arabinogalactan oligosaccharides. The synthesis of the pentasaccharide of the Mycobact. avium serovar 19 was recently accomplished. Our most attractive results include those which are in connection with the sulfonatomethyl mono- and oligosaccharide analogues of heparin. The disaccharides of the required heparin-pentasaccharides have been synthesized