Resistance of human haematopoietic cells against cytarabine after retrovirally mediated transfer of the cytidine deaminase gene

Hintergrund: Die Cytidindeaminase (CDD) detoxifiziert intrazellulär Cytarabin (Cytosin-Arabinosid). Überexpression des Enzyms in hämatopoetischen Zellen führt zu Resistenz gegenüber Cytarabin. Dies konnte bisher durch retroviralen CDD-Transfer in vitro für humane hämatopoetische Zelllinien sowie murine primäre hämatopoetische Zellen gezeigt werden. Mögliche klinische Anwendungen sind die Reduktion der Myelosuppression nach Cytarabin-Applikation oder die Verwendung als selektierbarer Marker. Methoden: Mit einem Vektor, der CDD und das enhanced green fluorescent protein (EGFP) trug, wurde durch Lipofektion eine transiente Produzentenzelllinie erzeugt. Mit deren Überstand wurde eine stabile Produzentenzellpopulation generiert, aus der mit Fluoreszenz-aktivierter Zellsortierung und Bestimmung des retroviralen Titers ein hoch EGFP-exprimierender Einzellklon identifiziert wurde. CD34+-Zellen aus humanem Nabelschnurblut wurden mit Zytokinen prästimuliert und durch Kultur im Überstand des Einzelzellklones transduziert. In Koloniebildungs-Versuchen in einer Verdünnungsreihe von Cytarabin wurde die Resistenz der CD34+-Zellen mit einer Kontrollpopulation verglichen, die mit einem EGFP-haltigen Vektor ohne CDD transduziert worden war. Das Wachstum von colony forming units – in culture (CFU-C) wurde als Maß der Protektion verwendet. Einzeln analysiert wurden die Untergruppen CFU - granuloyte/macrophage (CFU-GM) und burst forming units – erythrocyte (BFU-E) als Repräsentanten des myeloischen Kompartiments bzw. des erythropoetischen Kompartimentes. Durch PCR und Southern blot wurde der Nachweis proviraler DNA in den CFU geführt. Ergebnisse: Die Transduktionsrate in den CD34+-Zellen betrug 28 ± 2% (Standardabweichung des Mittelwertes SEM, n=4). Bei Konzentrationen von 20 – 100 nM war das Wachstum von CDD-transduzierten CFU-C signifikant höher, die inhibitorische Cytarabin-Dosis 50 lag mit 49nM ± 9 versus 27 ± 6 (SEM, n=6)) signifikant höher (n=6). Der protektive Effekt war bei BFU-E ausgeprägter als bei CFU-GM. Schlussfolgerung: In dieser Arbeit konnte das erste Mal in humanen primären CD34+-Zellen durch retroviralen CDD-Gentransfer vermittelte Resistenz gegenüber Cytarabin nachgewiesen werden. Experimente im murinen Modell haben inzwischen die Anwendbarkeit des Verfahrens in vivo gezeigt

Leitfaden zur Beurteilung von Aufbereitungsaufwand und Nachnutzbarkeit von Korpora gesprochener Sprache

Korpora gesprochener Sprache werden mindestens seit den 1950er Jahren von Sprachwissenschaftlern und Forschern anderer Disziplinen mit verschiedensten Forschungsinteressen aufgebaut. Die technischen Möglichkeiten für die Erhebung und Bereitstellung solcher Daten haben sich seitdem fortwährend und grundlegend gewandelt. Heute kann es als Normalfall angesehen werden, dass ein Korpus gesprochener Sprache digital erhoben wird. Die wissenschaftliche Community ist außerdem auf dem Wege, sich auf gewisse Mindeststandards zu einigen, die bei der Erhebung bezüglich Dokumentation, Strukturierung und Enkodierung der Daten eingehalten werden sollten, um eine möglichst nachhaltige Nutzung der Korpora zu ermöglichen. Verschiedene Datenzentren schließlich haben sich zum Ziel gesetzt, Korpora gesprochener Sprache zu einer eben solchen Nachnutzung dauerhaft zu archivieren und in digitalen Infrastrukturen bereitzustellen. Eine der wichtigsten Aufgaben solcher Zentren ist es, Korpora aus abgeschlossenen Projekten zu übernehmen und sie so aufzubereiten, dass eine dauerhafte Archivierung und Bereitstellung überhaupt möglich wird. Dieser Leitfaden basiert auf Erfahrungen, die hinsichtlich dieser Aufgabe an zwei Standorten – dem Sonderforschungsbereich 538 ‚Mehrsprachigkeit’ bzw. dem Zentrum für Sprachkorpora (HZSK) an der Universität Hamburg, sowie dem Archiv für gesprochenes Deutsch (AGD) am Institut für Deutsche Sprache in Mannheim – gesammelt wurden.1 Am SFB 538 (Laufzeit: 1999-2011) hatte das Projekt Z2 „Computergestützte Erfassungs- und Analysemethoden“ die Aufgabe übernommen, Korpora aus den Teilprojekten des SFB nach deren Abschluss für eine Archivierung und Nachnutzung vorzubereiten (siehe dazu Schmidt/Bennöhr 2007). Die Archivierung und Bereitstellung der Daten im Gesamtumfang von 30 Korpora erfolgt nun im zum Abschluss des SFB (2011) gegründeten HZSK (Hedeland/Lehmber /Schmidt/Wörner 2011). Das Archiv für Gesprochenes Deutsch bzw. dessen Vorläufer, das Deutsche Spracharchiv (Stift/Schmidt 2014), fungiert bereits seit den 1960er Jahren als eine zentrale Sammelstelle für Korpora des gesprochenen Deutsch. Im Laufe der Jahre hat es aus IDS-internen und -externen Projekten knapp 50 Korpora übernommen, die verschiedene Stadien der Aufbereitung erfahren haben und der wissenschaftlichen Gemeinschaft nun u.a. über die Datenbank für Gesprochenes Deutsch (DGD2, Schmidt/Dickgießer/Gasch 2013) zur Verfügung gestellt werden. Das derzeitige Angebot dieser beiden Einrichtungen zeigt, dass es prinzipiell möglich ist, von den im einleitenden Zitat beschriebenen Sammlungen zu dauerhaft nachnutzbaren digitalen 1 Die Konzeption dieses Leitfadens war Gegenstand eines Arbeitspakets im Projekt „Etablierung eines Schwerpunkts ‚Mehrsprachigkeit und Gesprochene Sprache‘ am Hamburger Zentrum für Sprachkorpora“, das von der Deutschen Forschungsgemeinschaft im Rahmen des Förderprogramms „Literaturversorgungs- und Informationssysteme (LIS)“ gefördert wurde. An der Umsetzung haben sich die genannten MitarbeiterInnen des HZSK und des AGD beteiligt.4 Ressourcen zu gelangen. Die Erfahrung zeigt aber auch, dass dies oft ein langwieriger Prozess mit vielen unvorhergesehenen Hindernissen ist, an dessen Ende man sich zumindest gelegentlich die Frage stellen kann, ob Aufwand und Nutzen der Datenaufbereitung in einem angemessenen Verhältnis zueinander stehen. Zweck dieses Leitfadens ist es, Kriterien für die Beurteilung von Aufbereitungsaufwand und Nachnutzbarkeit von Korpora gesprochener Sprache zu definieren, mittels derer bereits bei der Planung eines entsprechenden Projektes eine Abschätzung der Kosten und Nutzen getroffen werden kann. Kosten bezeichnen in diesem Kontext insbesondere den zeitlichen Arbeitsaufwand, der sich nicht immer leicht in monetäre Kosten umrechnen lässt. Die Nachnutzbarkeit definiert sich vor allem darüber, wie offen oder restriktiv der Zugang zum Korpus gestaltet wird und über die Quantität und Qualität der Korpusbestandteile. Der Leitfaden gliedert sich in sechs Abschnitte, die in Form von strukturierten Fragebäumen die wichtigsten Eigenschaften einer aufzubereitenden Ressource abfragen. Den Fragebäumen sind Erläuterungen zum besseren Verständnis der einzelnen Fragen vorangestellt. Die Pfade in den Fragebäumen führen jeweils zu einem "Ampelsymbol", anhand dessen über das weitere Vorgehen bei der Aufbereitung entschieden werden kann

New and future developments in EXMARaLDA

We present some recent and planned future developments in EXMARaLDA, a system for creating, managing, analysing and publishing spoken language corpora. The new functionality concerns the areas of transcription and annotation, corpus management, query mechanisms, interoperability and corpus deployment. Future work is planned in the areas of automatic annotation, standardisation and workflow management

Extending Tables with Data from over a Million Websites

Abstract. This Big Data Track submission demonstrates how the BTC 2014 dataset, Microdata annotations from thousands of websites, as well as millions of HTML tables are used to extend local tables with additional columns. Ta-ble extension is a useful operation within a wide range of application scenarios: Imagine you are an analyst having a local table describing companies and you want to extend this table with the headquarter of each company. Or imagine you are a film enthusiast and want to extend a table describing films with attributes like director, genre, and release date of each film. The Mannheim Search Joins Engine automatically performs such table extension operations based on a large data corpus gathered from over a million websites that publish structured data in various formats. Given a local table, the Mannheim Search Joins Engine searches the corpus for additional data describing the entities of the input table. The dis-covered data are then joined with the local table and their content is consolidated using schema matching and data fusion methods. As result, the user is presented with an extended table and given the opportunity to examine the provenance o

Treosulfan-based conditioning regimen for children and adolescents with hemophagocytic lymphohistiocytosis

In hematopoietic stem cell transplantation for hemophagocytic lymphohistiocytosis, high transplant-related mortality after busulfan-based myeloablative regimens has been observed. Conditioning regimens with reduced toxicity based on melphalan or treosulfan are promising alternatives. We retrospectively analyzed hematopoietic stem cell transplantations in 19 hemophagocytic lymphohistiocytosis patients after conditioning with fludarabine, treosulfan, alemtuzumab, with or without thiotepa. Overall and disease-free survivals were 100% (follow up 7-31 months). Two patients required second transplant (1 after haploidentical transplantation). In 6 patients, overall donor chimerism dropped below 75% and prompted donor lymphocyte infusions. Administration of donor lymphocytes or second transplantation were significantly more frequent after transplantation from a human leukocyte antigen mismatched (9/10) versus matched (10/10) donor (P=0.018). The toxicity profile was favorable, with one veno-occlusive disease, one grade 3 graft-versus-host disease after donor lymphocyte infusion, and 2 severe viral infections (1 influenza, 1 Epstein Barr virus). In conclusion, the treosulfan-based regimen in hemophagocytic lymphohistiocytosis is effective with low toxicity and gives excellent overall and disease-free survival rates. In the future, the incidence of mixed chimerism, particularly after human leukocyte antigen mismatched donor transplants, needs to be addressed

Treosulfan-based conditioning regimen for children and adolescents with hemophagocytic lymphohistiocytosis

In hematopoietic stem cell transplantation for hemophagocytic lymphohistiocytosis, high transplant-related mortality after busulfan-based myeloablative regimens has been observed. Conditioning regimens with reduced toxicity based on melphalan or treosulfan are promising alternatives. We retrospectively analyzed hematopoietic stem cell transplantations in 19 hemophagocytic lymphohistiocytosis patients after conditioning with fludarabine, treosulfan, alemtuzumab, with or without thiotepa. Overall and disease-free survivals were 100% (follow up 7-31 months). Two patients required second transplant (1 after haploidentical transplantation). In 6 patients, overall donor chimerism dropped below 75% and prompted donor lymphocyte infusions. Administration of donor lymphocytes or second transplantation were significantly more frequent after transplantation from a human leukocyte antigen mismatched (9/10) versus matched (10/10) donor (P=0.018). The toxicity profile was favorable, with one veno-occlusive disease, one grade 3 graft-versus-host disease after donor lymphocyte infusion, and 2 severe viral infections (1 influenza, 1 Epstein Barr virus). In conclusion, the treosulfan-based regimen in hemophagocytic lymphohistiocytosis is effective with low toxicity and gives excellent overall and disease-free survival rates. In the future, the incidence of mixed chimerism, particularly after human leukocyte antigen mismatched donor transplants, needs to be addressed

Stem cell transplantation for children with hemophagocytic lymphohistiocytosis: results from the HLH-2004 study

We report the largest prospective study thus far on hematopoietic stem cell transplantation (HSCT) in hemophagocytic lymphohistiocytosis (HLH), a life-threatening hyperinflammatory syndrome comprising familial/genetic HLH (FHL) and secondary HLH. Although all patients with HLH typically need intensive anti-inflammatory therapy, patients with FHL also need HSCT to be cured. In the international HLH-2004 study, 187 children aged ,18 years fulfilling the study inclusion criteria (5 of 8 diagnostic criteria, affected sibling, or molecular diagnosis in FHL-causative genes) underwent 209 transplants (2004-2012), defined as indicated in patients with familial/genetic, relapsing, or severe/persistent disease. Five-year overall survival (OS) post-HSCT was 66% (95% confidence interval [CI], 59-72); event-free survival (EFS) was 60% (95% CI, 52-67). Five-year OS was 81% (95% CI, 65-90) for children with a complete response and 59% (95% CI, 48-69) for those with a partial response (hazard ratio [HR], 2.12; 95% CI, 1.06-4.27; P 5 .035). For children with verified FHL (family history/genetically verified, n 5 134), 5-year OS was 71% (95% CI, 62-78) and EFS was 62% (95% CI, 54-70); 5-year OS for children without verified FHL (n 5 53) was significantly lower (52%; 95% CI, 38-65) (P 5 .040; HR, 1.69; 95% CI, 1.03-2.77); they were also significantly older. Notably, 20 (38%) of 53 patients without verified FHL had natural killer cell activity reported as normal at diagnosis, after 2 months, or at HSCT, suggestive of secondary HLH; and in addition 14 (26%) of these 53 children had no evidence of biallelic mutations despite having 3 or 4 FHL genes analyzed (natural killer cell activity not analyzed after 2 months or at HSCT). We conclude that post-HSCT survival in FHL remains suboptimal, and that the FHL diagnosis should be carefully investigated before HSCT. Pretransplant complete remission is beneficial but not mandatory to achieve post-HSCT survival.Fil: Bergsten, Elisabet. Karolinska Huddinge Hospital. Karolinska Institutet; SueciaFil: Horne, AnnaCarin. Karolinska Huddinge Hospital. Karolinska Institutet; SueciaFil: Hed Myrberg, Ida. Karolinska Huddinge Hospital. Karolinska Institutet; SueciaFil: Aricó, Maurizio. Children Hospital Giovanni XXIII; ItaliaFil: Astigarraga, Itziar. Universidad del País Vasco; EspañaFil: Ishii, Eiichi. Ehime University; JapónFil: Janka, Gritta. Universitat Hamburg; AlemaniaFil: Ladisch, Stephan. Children’s National Medical Center; Estados UnidosFil: Lehmberg, Kai. Universitat Hamburg; AlemaniaFil: McClain, Kenneth L.. Baylor College of Medicine; Estados UnidosFil: Minkov, Milen. Universidad de Viena; AustriaFil: Nanduri, Vasanta. Watford General Hospital; Reino UnidoFil: Rosso, Diego. Gobierno de la Ciudad de Buenos Aires. Hospital General de Niños Pedro Elizalde (ex Casa Cuna); Argentina. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Medicina. Hospital de Clínicas General San Martín; Argentina. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas; ArgentinaFil: Sieni, Elena. Universitaria A. Meyer Children Hospital; ItaliaFil: Winiarski, Jacek. Karolinska Huddinge Hospital. Karolinska Institutet; SueciaFil: Henter, Jan Inge. Karolinska Huddinge Hospital. Karolinska Institutet; Sueci

Reduced-Intensity/Reduced-Toxicity Conditioning Approaches Are Tolerated in XIAP Deficiency but Patients Fare Poorly with Acute GVHD

X-linked inhibitor of apoptosis (XIAP) deficiency is an inherited primary immunodeficiency characterized by chronic inflammasome overactivity and associated with hemophagocytic lymphohistiocytosis (HLH) and inflammatory bowel disease (IBD). Allogeneic hematopoietic cell transplantation (HCT) with fully myeloablative conditioning may be curative but has been associated with poor outcomes. Reports of reduced-intensity conditioning (RIC) and reduced-toxicity conditioning (RTC) regimens suggest these approaches are well tolerated, but outcomes are not well established. Retrospective data were collected from an international cohort of 40 patients with XIAP deficiency who underwent HCT with RIC or RTC. Thirty-three (83%) patients had a history of HLH, and thirteen (33%) patients had IBD. Median age at HCT was 6.5 years. Grafts were from HLA-matched (n = 30, 75%) and HLA-mismatched (n = 10, 25%) donors. There were no cases of primary graft failure. Two (5%) patients experienced secondary graft failure, and three (8%) patients ultimately received a second HCT. Nine (23%) patients developed grade II-IV acute GVHD, and 3 (8%) developed extensive chronic GVHD. The estimated 2-year overall and event-free survival rates were 74% (CI 55-86%) and 64% (CI 46-77%), respectively. Recipient and donor HLA mismatch and grade II-IV acute GVHD were negatively associated with survival on multivariate analysis with hazard ratios of 5.8 (CI 1.5-23.3, p = 0.01) and 8.2 (CI 2.1-32.7, p < 0.01), respectively. These data suggest that XIAP patients tolerate RIC and RTC with survival rates similar to HCT of other genetic HLH disorders. Every effort should be made to prevent acute GVHD in XIAP-deficient patients who undergo allogeneic HCT

Effective Immunological Guidance of Genetic Analyses Including Exome Sequencing in Patients Evaluated for Hemophagocytic Lymphohistiocytosis

We report our experience in using flow cytometry-based immunological screening prospectively as a decision tool for the use of genetic studies in the diagnostic approach to patients with hemophagocytic lymphohistiocytosis (HLH). We restricted genetic analysis largely to patients with abnormal immunological screening, but included whole exome sequencing (WES) for those with normal findings upon Sanger sequencing. Among 290 children with suspected HLH analyzed between 2010 and 2014 (including 17 affected, but asymptomatic siblings), 87/162 patients with "full" HLH and 79/111 patients with "incomplete/atypical" HLH had normal immunological screening results. In 10 patients, degranulation could not be tested. Among the 166 patients with normal screening, genetic analysis was not performed in 107 (all with uneventful follow-up), while 154 single gene tests by Sanger sequencing in the remaining 59 patients only identified a single atypical CHS patient. Flow cytometry correctly predicted all 29 patients with FHL-2, XLP1 or 2. Among 85 patients with defective NK degranulation (including 13 asymptomatic siblings), 70 were Sanger sequenced resulting in a genetic diagnosis in 55 (79%). Eight patients underwent WES, revealing mutations in two known and one unknown cytotoxicity genes and one metabolic disease. FHL3 was the most frequent genetic diagnosis. Immunological screening provided an excellent decision tool for the need and depth of genetic analysis of HLH patients and provided functionally relevant information for rapid patient classification, contributing to a significant reduction in the time from diagnosis to transplantation in recent years