Étude de l'homéostasie de la taille chez la levure opportuniste Candida albicans

L’homéostasie de la taille est un processus important de la prolifération cellulaire mais les mécanismes moléculaires sont mal compris. Les cellules eucaryotes doivent atteindre une taille seuil avant la division, ce qui permet de maintenir une taille constante sur le long terme. Ce processus est régulé à un point de contrôle, à la fin de la phase G1, appelé START chez les levures. Le contrôle de la taille cellulaire a été étudié chez la levure modèle Saccharomyces cerevisiae mais n’a jamais été étudié chez les levures pathogènes. Dans cette thèse, nous avons utilisé Candida albicans comme organisme modèle pour étudier la régulation de la taille chez les levures opportunistes. Nous avons criblé des collections de mutants de délétions hétérozygotes et homozygotes de C.albicans afin d’identifier des gènes régulateurs de la taille. Nous avons analysé la distribution de taille de 279 mutants homozygotes et 4 348 mutants hétérozygotes (recouvrant 90% du génome). Nous avons comparé nos résultats à différents criblages effectués sur la levure modèle S.cerevisiae. Ces comparaisons montrent que peu de régulateurs sont conservés entre C. albicans et S. cerevisiae et que la régulation de la taille est processus très plastique. Par exemple, le mutant dot6 a un phénotype petit chez C. albicans mais n’a pas de phénotype de taille chez S. cerevisiae. Nous avons montré que Dot6 est un facteur de transcription nécessaire pour l’activation des gènes de la biogénèse des ribosomes. Dot6 est également un régulateur de START et joue un rôle dans l’adaptation de la taille suivant les sources de carbone disponibles. Nous avons également mis en évidence un nouveau rôle pour la protéine kinase Hog1/p38 dans la régulation de la taille chez C. albicans en absence de stress. Ce rôle n’a jamais été démontré chez S. cerevisiae. Nous avons montré que Hog1, ainsi que toute la voie HOG, sont des régulateurs négatifs de START. Nous avons mis en évidence que Hog1 régule à la fois la croissance cellulaire via Sfp1, un régulateur majeur de la biogénèse des ribosomes et des protéines ribosomales, et le cycle cellulaire via le complexe SBF (Swi4/Swi6), des facteurs de transcription nécessaires pour la transition G1/S. Nous avons également découvert qu’Ahr1, un facteur de transcription n’ayant pas d’orthologue chez S. cerevisiae, est nécessaire pour la régulation de la taille et aussi requis pour l’adaptation de la taille en fonction des acides aminés disponibles. Nous avons montré qu’Ahr1 agit dans la voie Tor1-Sch9 et régule négativement START. En conclusion, notre travail a permis de découvrir de nouveaux régulateurs de START, de caractériser leur fonction et de les placer dans différentes voies. Comme la dérégulation de la voie Hog1/p38 est associée à des pathologies humaines, nous proposons C.albicans comme organisme modèle pour l’étude de cette voie et son implication dans l’homéostasie de la taille chez les organismes eucaryotes.Cell size homeostasis is an important process of cell proliferation but the molecular mechanisms are poorly understood. Eukaryotic cells must reach a threshold size before entering the cell cycle, which helps to maintain a constant size over the long term. This process is regulated at the end of the G1 phase, a check point called START. Cell size control has been studied in the model yeast Saccharomyces cerevisiae but has never been studied in pathogenic fungi. In this thesis, we used Candida albicansas a model organism to study the regulation of size in pathogenic yeasts. We have screened heterozygous and homozygous deletion collections of C. albicans to identify genes that control cell size. We analyzed the size distribution of 279 homozygous mutants and 4,348 heterozygous mutants (covering 90% of the genome). We compared our results with different screens performed on the model yeast S.cerevisiae. These comparisons showed that few regulators were conserved between S. cerevisiaeand C. albicans and suggesting that the cell size regulation is evolutionary plastic. For example, dot6 mutant has a small phenotype in C. albicansbut has no size phenotype in S. cerevisiae. We have shown that Dot6 is a transcriptional factor necessary for the activation of ribosome biogenes is genes. Dot6 is also a regulator of START and plays a critical role in adapting size according to the carbon sources available in the medium. We also uncovered a novel stress-independent role of the Hog1/p38 MAPK in size regulation in C. albicansa role that has never been demonstrated in S. cerevisiae. We have shown that Hog1, as well as the entire HOG pathway, are negative regulators of START. We have shown that Hog1 regulates both growth via Sfp1, a major transcriptional regulator of ribosomal biogenesis and ribosomal proteins, and the cell cycle via the SBF complex (Swi4/Swi6), transcriptional factors necessary for the G1/S transition. We also found that Ahr1, a transcription factor with no obvious ortholog in S. cerevisiae, has a role for the adaptation of the size according to the amino acids available in the medium. We have shown that Ahr1 is a negative START regulator and is controlled by the Tor1-Sch9 pathway. In conclusion, our work has permitted to discover new regulators of START, to characterise their function and to map them in different pathways. As the Hog1/p38 pathway is linked to many human pathologies, we think that C.albicansis a useful model to study of this pathway and dissect its role in size control in eukaryotes

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Genome-Wide Screen for Haploinsufficient Cell Size Genes in the Opportunistic Yeast Candida albicans

One of the most critical but still poorly understood aspects of eukaryotic cell proliferation is the basis for commitment to cell division in late G1 phase, called Start in yeast and the Restriction Point in metazoans. In all species, a critical cell size threshold coordinates cell growth with cell division and thereby establishes a homeostatic cell size. While a comprehensive survey of cell size genetic determinism has been performed in the saprophytic yeasts Saccharomyces cerevisiae and Schizosaccharomyces pombe, very little is known in pathogenic fungi. As a number of critical Start regulators are haploinsufficient for cell size, we applied a quantitative analysis of the size phenome, using elutriation-barcode sequencing methodology, to 5639 barcoded heterozygous deletion strains of the opportunistic yeast Candida albicans. Our screen identified conserved known regulators and biological processes required to maintain size homeostasis in the opportunistic yeast C. albicans. We also identified novel C. albicans-specific size genes and provided a conceptual framework for future mechanistic studies. Interestingly, some of the size genes identified were required for fungal pathogenicity suggesting that cell size homeostasis may be elemental to C. albicans fitness or virulence inside the host

Three members of the yeast N-BAR proteins family form heterogeneous lattices in vivo and interact differentially with two RabGAP proteins

The yeast N-BAR (Bin/Amphiphysin/Rvs167) protein Rvs167 is recruited by the Rab GTPase Activating Proteins (RabGAP) Gyp5 and Gyl1 to the tip of small buds to act in exocytosis. Investigating other N-BAR proteins involved in Gyp5/Gyl1/Rvs167 complexes, we found that Rvs161, an Rvs167 paralog, is absent from the complexes formed at the tip of small buds. Immunoprecipitation and Bimolecular Fluorescence Complementation (BiFC) analysis show that both Rvs167 and Rvs161 interact in vivo with Gvp36, an N-BAR protein. Rvs167 molecules also interact independently of Rvs161 and Gvp36. Rvs167/Rvs167 and Rvs167/Gyp5 interactions predominate over other combinations at the tip of small buds, suggesting that N-BAR lattices enriched in Rvs167 molecules form at these sites. By combining BiFC with markers specific to each organelle, we analyzed systematically in living cells the locations of the BiFC signals generated by combinations of the three N-BAR proteins. We show that the BiFC signals differ according to organelle and cell site, strongly suggesting heterogeneity in the composition of N-BAR protein lattices in vivo. Our results reveal that the organization of N-BAR protein lattices in vivo is complex and are consistent with N-BAR proteins forming various types of dimers and lattices of variable composition

pH-Dependant Antifungal Activity of Valproic Acid against the Human Fungal Pathogen Candida albicans

Current antifungal drugs suffer from limitations including toxicity, the emergence of resistance and decreased efficacy at low pH that are typical of human vaginal surfaces. Here, we have shown that the antipsychotic drug valproic acid (VPA) exhibited a strong antifungal activity against both sensitive and resistant Candida albicans in pH condition similar to that encountered in vagina. VPA exerted a strong anti-biofilm activity and attenuated damage of vaginal epithelial cells caused by C. albicans. We also showed that VPA synergizes with the allylamine antifungal, Terbinafine. We undertook a chemogenetic screen to delineate biological processes that underlies VPA-sensitivity in C. albicans and found that vacuole-related genes were required to tolerate VPA. Confocal fluorescence live-cell imaging revealed that VPA alters vacuole integrity and support a model where alteration of vacuoles contributes to the antifungal activity. Taken together, this study suggests that VPA could be used as an effective antifungal against vulvovaginal candidiasis

Comparison of three methods for oxidative stress-induced potassium efflux measurement

International audienceThe aim of the study was to compare the potassium efflux measurements (flame photometry (FP), specific electrode (SE) and atomic absorption photometry (AAP)) using a model of erythrocytes exposed to an oxidative stress in various conditions of osmolarity. Human erythrocytes were incubated in 3 different values of osmolarity and in the presence of 50 mM AAPH, potassium efflux was measured by FP, SE and AAP at t = 0 and every 30 min for 2 h. These methods were similar for the measurement of global potassium efflux. However, SE detected important amounts of potassium at the beginning of the experiment or in absence of AAPH in comparison with AAP and FP. It is noteworthy that these different methods of measurements were not altered by the osmolarity. FP and AAP make it possible to study the potassium efflux during oxidative stress while SE should be used only for global measurements

Courtois-sur-Yonne (89), route de Nailly. Du Néolithique final à la Tène finale dans la vallée de l'Yonne : occupations domestiques et dépôts en silo.

Le site de Courtois-sur-Yonne Route de Nailly témoigne d’une occupation diachronique s’échelonnant du Néolithique final à La Tène finale.La période du Néolithique final est mise en lumière par la présence d’une sépulture à inhumation et de rares indices matériels de fréquentation du site trouvés hors contexte. L’âge du Bronze final, beaucoup plus fourni en vestiges mobiliers, est caractérisé par la présence de fosses d’extraction réutilisées pour certaines en dépotoirs. Le mobilier détritique retrouvé en abondance dans deux de ces fosses témoigne de la présence d’un habitat à proximité. Après un hiatus chronologique au début du premier âge du Fer, l’occupation reprend durant le Hallstatt D-La Tène A. Celle-ci s’observe au travers de l’implantation de structures d’ensilage de formes et dimensions variées dont un alignement de dix silos cylindriques et tronconiques de très gros volume. Le mobilier, retrouvé en position de rejet dans les petits silos domestiques et dans une fosse d’extraction, atteste, tout comme pour la période précédente, de la présence d’un habitat proche voire sur le site. L’abandon de ces structures en tant que lieu de stockage marque le début d’une nouvelle phase de fréquentation tournée vers le funéraire. Certains silos de grandes dimensions sont réutilisés en lieu de dépôts humains et animaux.Une variété de pratiques rituelles est observée durant La Tène ancienne-moyenne au travers de dépôts primaires, secondaires, de manipulations et d’interventions sur les défunts. Enfin, la période de La Tène finale est entraperçue lors de rares recreusements dans les parties sommitales de ces structures

Courtois-sur-Yonne (89), route de Nailly. Du Néolithique final à la Tène finale dans la vallée de l'Yonne : occupations domestiques et dépôts en silo.

Le site de Courtois-sur-Yonne Route de Nailly témoigne d’une occupation diachronique s’échelonnant du Néolithique final à La Tène finale.La période du Néolithique final est mise en lumière par la présence d’une sépulture à inhumation et de rares indices matériels de fréquentation du site trouvés hors contexte. L’âge du Bronze final, beaucoup plus fourni en vestiges mobiliers, est caractérisé par la présence de fosses d’extraction réutilisées pour certaines en dépotoirs. Le mobilier détritique retrouvé en abondance dans deux de ces fosses témoigne de la présence d’un habitat à proximité. Après un hiatus chronologique au début du premier âge du Fer, l’occupation reprend durant le Hallstatt D-La Tène A. Celle-ci s’observe au travers de l’implantation de structures d’ensilage de formes et dimensions variées dont un alignement de dix silos cylindriques et tronconiques de très gros volume. Le mobilier, retrouvé en position de rejet dans les petits silos domestiques et dans une fosse d’extraction, atteste, tout comme pour la période précédente, de la présence d’un habitat proche voire sur le site. L’abandon de ces structures en tant que lieu de stockage marque le début d’une nouvelle phase de fréquentation tournée vers le funéraire. Certains silos de grandes dimensions sont réutilisés en lieu de dépôts humains et animaux.Une variété de pratiques rituelles est observée durant La Tène ancienne-moyenne au travers de dépôts primaires, secondaires, de manipulations et d’interventions sur les défunts. Enfin, la période de La Tène finale est entraperçue lors de rares recreusements dans les parties sommitales de ces structures