Peptídeos sintéticos para diagnóstico e imunoprofilaxia da Leishmaniose tegumentar americana

Orientadora : Profª Drª Vanete Thomaz-SoccolCo-orientadora : Profª Drª Silvana Maria AlbanTese (doutorado) - Universidade Federal do Paraná, Setor de Ciências Biológicas, Programa de Pós-Graduação em Ciencias Biológicas (Microbiologia, Parasitologia e Patologia Básica). Defesa: Curitiba,26/07/2014Inclui referênciasÁrea de concentração: ParasitologiaResumo:As leishmanioses são causadas por protozoários do gênero Leishmania Ross, 1903. Esta doença é uma das principais parasitoses negligenciadas, re-emergentes e afeta cerca de 350 milhões de indivíduos no mundo. O objetivo deste trabalho foi identificar peptídeos miméticos, para uso como antígenos em imunodiagnóstico e imunoprofilaxia da leishmaniose tegumentar americana (LTA). Bacteriófagos, expressando peptídeos em sua superfície, foram selecionados por imunoglobulinas específicas para Leishmania (Vianna) braziliensis (L. braziliensis). Posteriormente os mesmos foram submetidos à extração e sequenciamento do seu DNA. Três peptídeos (P-1, P-2 e P-3) foram identificados, sintetizados e inoculados individualmente ou combinados (MIX) em hamsters golden. Os animais imunizados com peptídeos produziram anticorpos que reconheceram diferentes proteínas do antígeno solúvel (AS) de L. braziliensis. A comparação das sequências dos três peptídeos, em banco de dados, demonstrou que elas apresentam homologia com glicoproteína de 63 kDa de Leishmania, lipofosfoglicano e com outras proteínas hipotéticas de Leishmania. Os peptídeos foram avaliados como antígenos no teste ELISA indireto. Dois grupos de pacientes foram investigados, sendo o primeiro constituído por 25 indivíduos que tiveram diagnóstico parasitológico confirmado e o segundo por 57 pacientes que apresentavam suspeita clínica de LTA, eram moradores de área endêmica e que tinham teste sorológico positivo para a doença. Os três peptídeos e o MIX foram imunorreativos contra soro de pacientes dos dois grupos. O peptídeo 1, 2, 3, MIX e AS reagiram com 64, 56, 44/56, 40/72 e 80% das amostras de soro, respectivamente. No Grupo 2, os três peptídeos só ou em combinação foram capazes de diagnosticar 82 a 84% dos indivíduos. Para obtenção do ponto de corte (Cut-off) entre soros positivos e negativos dois cálculos foram aplicados. O primeiro foi realizado calculando a média das absorbâncias obtidas para um grupo de indivíduos considerados negativos e acrescidos de dois desvios padrão (2SD) e o segundo foi empregando a Curva ROC (Receiver Operating Characteristics). As sensibilidades do teste ELISA utilizando os peptídeos foram de 64 a 74% para o peptídeo 1, 56 a 65% para o peptídeo 2, 44 a 68% para o peptídeo 3, 40 a 79% para o MIX e de 80 e 91% para o AS. O MIX de peptídeos apresentou o melhor desempenho (79% de sensibilidade) entre os peptídeos seguido do P-1 (74%). A aplicação do teste t sugeriu que o P-1 seria melhor alternativa entre os peptídeos para o diagnóstico da LTA. As especificidades dos antígenos variaram de 92 a 100% demonstrando a habilidade destes em diagnosticar corretamente os indivíduos sadios. Reações cruzadas com soros de pacientes com doença de chagas, hanseníase e tuberculose foram avaliadas contra todos os antígenos. A reação cruzada com soro de pacientes com doença de chagas foi 0% para o P-1 enquanto que para o AS foi 60%. Os peptídeos sintéticos também foram testados em ensaios de imunoproteção contra leishmaniose experimental (LE) em hamsters. Foi possível observar que os animais do grupo controle positivo (que receberam o desafio com L. braziliensis e não receberam peptídeos) apresentaram lesões específicas de LE, enquanto que os animais imunizados com os peptídeos individualmente ou em combinação não apresentaram lesões ou as apresentaram em menor número. Os animais que receberam o peptídeo 2 não desenvolveram lesões. Promastigotas de L. braziliensis foram isoladas, em meio de cultura, da pata, baço e fígado de animais de todos os grupos, com exceção do grupo dois e do grupo controle negativo. Essas análises demonstram que a metodologia selecionada para a realização dessa pesquisa foi adequada, visto que sequências peptídicas com homologia aos principais fatores de virulência de Leishmania sp. foram obtidas, resultados promissores em testes sorológicos de diagnóstico foram alcançados e imunoproteção de animais contra a leishmaniose experimental foi observada. Palavras-chave: Phage display. leishmaniose. ELISA. Vacinas.Abstract: Leishmaniosis are caused by protozoan parasites of the genus Leishmania Ross, 1903. This is one of the main neglected, re-emerging parasitic diseases and affects about 350 million people worldwide. The objective of this study was to identify mimetic peptides to use as antigens in immunodiagnosis and immunoprophylaxis of American Cutaneous Leishmaniosis (ACL). Bacteriophages expressing peptides on their surface were selected by specific immunoglobulins for Leishmania (Vianna) braziliensis (L. braziliensis). Subsequently, they were subjected to DNA extraction and sequencing. Three peptides (P-1, P-2 e P-3) were identified, synthesized and individually or combined (MIX) inoculated in Golden hamsters. Animals immunized with peptides produced antibodies that recognized different proteins from the Soluble Antigen (SA) from L. braziliensis. Comparison of the sequences of the three peptides in database showed that they have similarity with a 63 kDa glycoprotein of Leishmania, a lipophosphoglycan and other hypothetical proteins of Leishmania. The peptides were evaluated as antigens in indirect ELISA. Two groups of patients were studied: the first consists of 25 individuals who had confirmed parasitological diagnosis and the second group of 57 patients who had clinical suspicion of ACL and were residents of endemic area and also had a positive serologic test for the disease. The three peptides and the MIX were immunoreactive against sera of patients in both groups. Peptide 1, 2, 3, MIX and AS were reactive with 64, 56, 44/56, 40/72 and 80% sera samples, respectively. In Group 2, the three peptides alone or in combination were able to diagnose 82 a 84% of individuals. In order to obtain the cut-off between positive and negative sera, two calculations were applied. The first one was conducted by calculating the mean absorbance obtained for a group of individuals considered negative plus two standard deviations (2SD). The second calculation was using the ROC curve (Receiver Operating Characteristics). The sensibility of the ELISA assay using the peptides were 64 to 74% for peptide 1, 56 to 65% for peptide 2, 44 to 68% for peptide 3, 40 to 79% for the MIX and 80 to 91% for the SA. The MIX of peptides showed the best performance (79%) among the peptides followed by P-1 (74%). The application of the t-test suggested that P-1 was the best alternative among the peptides for the diagnosis of ACL.The specificities of antigens ranged from 92% to 100% demonstrating the ability to correctly diagnose the healthy individuals. Cross-reactions with sera from patients with Chagas disease, leprosy and tuberculosis were evaluated against all antigens. Cross-reactivity with Chagas disease was zero for the P-1 and 60% for SA. The synthetic peptides were also tested in assays of immune protection against experimental Leishmaniosis (EL) in hamsters. It was possible to observe that the animals in the positive control group (that received a challenge with L. braziliensis and did not receive peptides) presented specific lesions of EL, whereas animals immunized with the peptides alone or in combination presented a few or no lesions. The animals receiving the peptide 2 did not develop lesions. Promastigotes of L. braziliensis were isolated in culture medium from the paw, spleen and liver from animals of all groups except group 2 and negative control group. These analysis show that the methodology selected for this study was appropriate. Since peptide sequences with homology to the main virulence factors of Leishmania sp. were obtained, promising results in serological diagnostic tests were achieved and immune protection of animals against EL was observed. Keywords: Phage display. Leishmaniosis. ELISA. Vaccines

Perfil soroepidemiológico da infecção pelo vírus da hepatite B notificado no município de São Miguel do Oeste, Santa Catarina

A hepatite B é uma doença causada pelo vírus HBV, que se replica ativamente no fígado de pacientes infectados, podendo manifestar-se de forma crônica, aguda ou fulminante. O objetivo deste estudo foi avaliar o perfil soroepidemiológico da infecção pelo vírus da hepatite B no município de São Miguel do Oeste, SC. Foram analisados 40 prontuários de pacientes portadores do vírus da hepatite B no período de janeiro a dezembro de 2008, localizados na Secretaria de Saúde Pública de São Miguel do Oeste, SC. Destes 40 prontuários, 52,5% eram do sexo feminino e 47,5% do sexo masculino; a maioria (30%) estava entre 21 e 30 anos de idade. No que diz respeito à escolaridade, 20 pacientes (50%) apresentavam ensino médio completo e 13 portadores (32,5,%), ensino médio incompleto. Além disso, destes 40 portadores, 4 (10%) apresentaram o vírus da imunodeficiência humana (HIV) associado ao vírus da hepatite B. Também se observou que a maioria (67,5%) dos portadores estudados não mosntrou nenhuma das três doses da vacina contra o vírus da hepatite B. Quando perguntado aos portadores sobre a proximidade com pessoas, estes mencionaram ter contato próximo com 70 pessoas. Destas, 34,3% tiveram relação sexual com o portador e 23 familiares (32,9%) não estavam vacinados ou não sabiam se estavam. Nesse sentido, considera-se que este trabalho foi de grande importância para a nossa região e se sugere que sejam desenvolvidos programas de ações educativas e permanentes, visando à prevenção e ao controle desta doença na região. Palavras-chave: Hepatite B. Vírus HBV. Doença hepática viral. Vacinação. Marcadores sorológicos

Avaliação dos casos de atendimento antirrábico humano notificados no município de São Miguel do Oeste – SC no ano de 2009

A raiva é uma antropozoonose cujo agente etiológico é o vírus rábico, um rabdovírus transmitido por mamíferos que provoca um quadro de encefalomielite aguda, geralmente letal, sendo um sério problema de saúde pública em países pobres e em desenvolvimento, incluindo o Brasil. O objetivo deste estudo foi avaliar a situação epidemiológica da raiva humana no município de São Miguel do Oeste, durante o ano de 2009. Foram analisadas 47 fichas de notificação de atendimento antirrábico humano entre janeiro e dezembro de 2009. Como encontrado em outros estudos, os cães estiveram envolvidos na maior parte das agressões, com um percentual de 87,2% dos casos notificados, ressaltando a importância das campanhas de vacinação da população canina. Também foram notificadas agressões por parte de gatos e suínos. Dos 47 indivíduos que procuraram o atendimento antirrábico nos postos de saúde do município, 74,5% residem em zona urbana; em 91,5% dos casos o procedimento adotado foi a observação do animal agressor. Em apenas dois casos foi realizada a vacinação, pelo fato de o animal envolvido estar na condição de morto/desaparecido e, em apenas outros dois casos, foi efetuada a aplicação de soro antirrábico mais a vacina por envolverem animais suspeitos. A maioria dos pacientes era crianças e adolescentes em fase escolar, o que sugere uma conscientização direcionada a esse grupo de pessoas. Por fim, a raiva é uma doença controlada no município de São Miguel do Oeste, não tendo sido diagnosticado nenhum caso de raiva, tanto humana quanto animal, no entanto, é importante que a população seja conscientizada em relação aos diferentes aspectos da doença e que as campanhas de vacinação de animais domésticos sejam intensificadas.Palavras-chave: Raiva. Vírus rábico. Epidemiologia. Profilaxia

Prevalência de parasitas intestinais na população do Bairro Salete, município de São Miguel do Oeste, SC

Os parasitas intestinais estão entre os patógenos mais frequentes encontrados em seres humanos. Os danos que os enteroparasitas podem causar a seus portadores incluem, entre outros agravos, obstrução intestinal, desnutrição, anemia, quadros de diarreia e má-absorção; as manifestações clínicas são usualmente proporcionais à carga parasitária albergada pelo indivíduo. No Extremo-Oeste de Santa Catarina, pouco se conhece sobre a prevalência das parasitoses intestinais. Esse trabalho teve como objetivo avaliar a presença de parasitas intestinais em amostras de fezes dos moradores do Bairro Salete, município de São Miguel do Oeste (SC), e relacionar a presença de enteroparasitoses com a escolaridade dos indivíduos e saneamento básico da região de estudo. Os resultados demostraram menor prevalência nessa população de parasitas intestinais quando comparada a populações semelhantes. No entanto, verificaram-se condições favoráveis à presença de parasitas intestinais, como altos índices de analfabetismo e ensino fundamental incompleto na população estudada, que interessantemente foi relacionado com uma tendência para parasitas intestinais. Palavras-chave: Enteroparasitas. Prevalência. Saneamento básico

Transações entre os agentes: cooperativas, Agroindústria Aurolat e distribuidores

A pesquisa foi realizada na Agroindústria Aurolat – Unidade Industrial de Lácteos – Cooperativa Central Oeste Catarinense, por meio de entrevista direta junto ao gerente geral da unidade; objetivou conhecer as transações existentes entre os agentes, cooperativas, Agroindústria Aurolat e distribuidores. O design da pesquisa compreende uma pesquisa exploratória por meio de estudo de caso, com abordagem qualitativa. Evidências do estudo: Nas transações existentes entre cooperativas, Agroindústria Aurolat e distribuidores, destaca-se a característica da “incerteza”. No caso das transações com as cooperativas singulares, pela fragilidade da variável matéria-prima (suprimento, concorrência e pericibilidade), e no caso dos distribuidores, pela questão da continuidade dos contratos para ambas as partes, em que os interesses devem convergir motivados pela rentabilidade, devendo gerar bons resultados econômicos para as duas partes. Em ambas as transações, os riscos são minimizados pela existência e execução de contratos. Despertam atenção as transações entre a Aurolat e seus distribuidores em termos de comportamento oportunístico, motivado por relações comerciais (menor custo, maior benefício) que deveriam se harmonizar com os princípios cooperativistas, bem como em termos de especificidade “capital humano”, em que os distribuidores são especialistas no negócio, conhecem todo o mercado consumidor, com forte tendência a, se houver ruptura de contrato, o cliente se manter mais fiel ao distribuidor que à indústria. As transações estudadas parecem possuir como grande desafio a busca de harmonia entre diferentes interesses, ou seja, transações baseadas em princípios doutrinários cooperativistas (sociedade de pessoas) e transações baseadas em princípios comerciais (sociedade de capital). Entende-se como importante uma sequência ao estudo, investigando estratégias organizacionais que conciliem a “convivência” das transações entre organizações cooperativas e não cooperativas, buscando um relacionamento baseado na visão sistêmica necessária ao sistema agroindustrial do leite. Palavras-chave: Sistema agroindustrial. Agribusiness cooperativo. Setor lácteo

Prevalência de parasitas intestinais em crianças de Descanso – Santa Catarina – Brasil

As enteroparasitoses representam um importante problema de saúde pública, sobretudo nos países subdesenvolvidos, nas quais as condições de saneamento básico e de higiene pessoal são precárias. As crianças em idade escolar são as mais comumente acometidas por parasitoses intestinais, o que afeta seu desenvolvimento físico e psicossomático. No Extremo-Oeste catarinense, há poucos dados acerca da prevalência de enteroparasitas em crianças. O objetivo deste estudo foi determinar a prevalência de parasitas intestinais em crianças de um centro de educação infantil municipal de Descanso – SC. Foram analisadas 73 amostras de fezes, pelo método de Hoffman, Pons & Janer ou Lutz. O coeficiente geral de prevalência foi de 2,74%, sendo Ascaris lumbricoides o parasita mais encontrado. A frequência de enteroparasitoses no grupo analisado é considerada baixa em comparação a outros estudos semelhantes, o que reflete as boas condições sanitárias e de higiene dessa população. Salienta-se que os programas de educação em saúde desenvolvidos com as escolares e as famílias contribuem para a prevenção das parasitoses intestinais, reduzindo os índices de positividade, de modo a garantir melhor qualidade de vida à população infantil, principalmente no que diz respeito ao seu desenvolvimento e aprendizado. Palavras-chave: Enteroparasitoses. Prevalência. Saneamento básico.

EFEITO DO DECANOATO DE NANDROLONA NO DESMAME VENTILATÓRIO DIFÍCIL DE PACIENTES DE UMA UTI

Objetivo: Avaliar os possíveis efeitos de drogas androgênicas em pacientes que apresentavam Desmame Ventilatório (DV) difícil, internados em uma Unidade de Terapia Intensiva (UTI). Material e métodos: realizou-se um estudo caso-controle no qual os pacientes apresentavam DV difícil, Ventilação Mecânica (VM) prolongada e sofreram ação de Decanoato de Nandrolona (DN) ou não (Grupo Controle). Os dois grupos citados foram compostos por 11 pacientes cada e foram analisados os dados clínicos a partir dos prontuários médicos. Os pacientes dos dois grupos de estudo apresentaram semelhanças que possibilitaram as análises futuras. Resultados e conclusão: o número de óbitos observados ao final do estudo foi o mesmo em ambos os grupos, porém houve diferença no período em que ocorreram as mortes. Outros dados relevantes que apresentaram significância entre os grupos foram a ventilação por pressão de suporte, tempo em nutrição e tempo de internação. Estes resultados podem relacionar-se a ação que os pacientes sofreram por receberem DN, visto que o uso do esteroide aumentou a sobrevida dos pacientes sem alterar a mortalidade, permitindo assim maior tempo para intervenções e tratamentos para recuperação dos pacientes em estados graves

Synthetic Peptides as Potential Antigens for Cutaneous Leishmaniosis Diagnosis

This work's goal was to research new candidate antigens for cutaneous leishmaniosis (CL). In order to reach the goal, we used random peptide phage display libraries screened using antibodies from Leishmania braziliensis patients. After selection, three peptides (P1, P2, and P3) were synthesized using Fmoc chemistry. The peptides individually or a mixture of them (MIX) was subsequently emulsified in complete and incomplete Freund's adjuvant and injected subcutaneously in golden hamsters. Sera from the hamsters administered with P1 presented antibodies that recognized proteins between 76 and 150 kDa from L. braziliensis. Sera from hamsters which had peptides P2 and P3, as well as the MIX, administered presented antibodies that recognized proteins between 52 and 76 kDa of L. braziliensis. The research on the similarity of the peptides' sequences in protein databases showed that they match a 63 kDa glycoprotein. The three peptides and the MIX were recognized by the sera from CL patients by immunoassay approach (ELISA). The peptides' MIX showed the best performance (79% sensitivity) followed by the P1 (72% sensitivity), and the AS presented 91% sensitivity. These results show a new route for discovering molecules for diagnosis or for immunoprotection against leishmaniosis

Decreased production of TNF-alpha by lymph node cells indicates experimental autoimmune encephalomyelitis remission in Lewis rats

Experimental autoimmune encephalomyelitis (EAE) is mediated by CD4+ Th1 cells that mainly secrete IFN-γ and TNF-α, important cytokines in the pathophysiology of the disease. Spontaneous remission is, in part, attributed to the down regulation of IFN-γ and TNF-α by TGF-β. In the current paper, we compared weight, histopathology and immunological parameters during the acute and recovery phases of EAE to establish the best biomarker for clinical remission. Female Lewis rats were immunised with myelin basic protein (MBP) emulsified with complete Freund's adjuvant. Animals were evaluated daily for clinical score and weight prior to euthanisation. All immunised animals developed the expected characteristics of EAE during the acute phase, including significant weight loss and high clinical scores. Disease remission was associated with a significant reduction in clinical scores, although immunised rats did not regain their initial weight values. Brain inflammatory infiltrates were higher during the acute phase. During the remission phase, anti-myelin antibody levels increased, whereas TNF-α and IFN-γ production by lymph node cells cultured with MBP or concanavalin A, respectively, decreased. The most significant difference observed between the acute and recovery phases was in the induction of TNF-α levels in MBP-stimulated cultures. Therefore, the in vitro production of this cytokine could be used as a biomarker for EAE remission