Extracellular matrix in hematopoiesis and hematologic malignancies

The extracellular matrix (ECM) is a complex structure composed of collagens, proteoglycans, glycosaminoglycans and adhesive glycoproteins. Interactions between the cells and the ECM are crucial to determine cell behavior, such as growth, death, differentiation and motility. Hematopoiesis is the system responsible for the production of blood cells. The control of proliferation and differentiation of these cells is attained through the interaction of the cells with the bone marrow microenvironment. The adhesion of hematopoietic progenitors to ECM molecules and the integrin activation are modulated by a variety of cytokines and growth factors, and this modulation seems to be the mechanism of regulation that influences proliferation of hematopoietic cells, transendothelial/transstromal migration and homing. Both in the migration and homing process, and in tumoral invasion the cells undergo the following steps: 1 - Degradation of the ECM by enzymes, including metalloproteinase, collagenase, plasmin, cathepsin, glycosidase and heparanase, secreted by the cells; 2 - Cell migration through the region previously degraded by enzymes; and 3 - Cell adhesion to specific receptors located on the cellular surface, that generally interact with ECM components. In onco-hematologic diseases, the interaction of neoplastic cells with the extracellular matrix also influences aggressiveness and prognosis of the disease.A matriz extracelular (MEC) é uma rede complexa composta por quatro grandes classes de macromoléculas: colágenos, proteoglicanos (PGs), glicosaminoglicanos (GAGs) e glicoproteínas adesivas. As interações entre as células e a MEC são cruciais para determinar os padrões de comportamento celular, tais como crescimento, morte, diferenciação e motilidade. A hematopoese é o sistema responsável pela produção das células sangüíneas. O controle da proliferação e diferenciação destas células é feito através da interação das células com o microambiente da medula óssea (matriz extracelular). A adesão de progenitores hematopoéticos a moléculas da MEC e a ativação das integrinas são modulados por uma variedade de citocinas e fatores de crescimento, e esta modulação parece ser o mecanismo de regulação que influencia a proliferação de células-tronco e progenitores hematopoéticos, migração transendotelial ou transestromal e homing. Tanto no processo de migração, homing e invasão tumoral, as células seguem os seguintes passos: 1 - Degradação da MEC por enzimas secretadas pelas células: metaloproteinases, colagenases, plasmina, catepsinas, glicosidases e heparanases; 2 - Locomoção das células na região da MEC previamente degradada pelas enzimas; 3 - Adesão das células via receptores específicos da superfície celular, que geralmente interagem com componentes da MEC. Nas doenças onco-hematológicas, a interação das células neoplásicas com a matriz extracelular também influencia na agressividade e prognóstico da doença.Universidade Federal de São Paulo (UNIFESP)UNIFESPSciEL

Efeito do epitélio na absorção corneana de raios ultravioleta-A e riboflavina

PURPOSE: To determine if the corneal epithelium prevents the collagen cross-linking effect. Using immunofluorescence microscopy after CXL, we indirectly analyzed the role of the epithelium as ultraviolet-A (UVA) shield as well as a barrier to riboflavin penetration. METHODS: Fifteen freshly enucleated porcine eyes were divided into 3 groups. The corneal epithelium was kept intact in all groups. Five eyes served as control (Group 1). On group 2, eyes received tetracaine anesthetic drops and topical 0.1% riboflavin solution (10 mg riboflavin-5-phosphate in 10 mL 20% dextran-T-500). On Group 3, riboflavin was injected into the anterior chamber to allow penetration of the drug through the endothelium. Groups 2 and 3 were exposed to UVA (365 nm, 3 mW/cm²) for 30 minutes. Ultra-thin sections (8 µm) of the corneas were stained with anti-collagen type I and DAPI (4,6-diamidino-2-fenilindole dihydrocloride) and analyzed with fluorescence microscopy. RESULTS: Corneas treated with UVA irradiation and intracameral injection of riboflavin (Group 3) showed greater pattern of collagen organization compared to groups 1 (Control) and 2 (riboflavin and tetracaine eye drops). A yellow stromal staining, which represents the riboflavin diffusion into the stroma, was only observed in eyes injected with riboflavin into the anterior chamber. CONCLUSION: Using immunofluorescence microscopy in porcine corneas, we demonstrated that the corneal epithelium reduces the effectiveness of CXL by preventing the penetration of the drug and not by limiting the UVA transmittance. An inadequate intrastromal concentration of riboflavin may impair CXL effect.OBJETIVO: Determinar se o epitélio corneano pode impedir ou diminuir o efeito do tratamento com cross-linking (CXL). Por meio de microscopia por imunofluorescência, foi indiretamente analisado o efeito do epitélio como escudo aos raios ultravioleta-A (UVA), assim como barreia à penetração da riboflavina. MÉTODOS: Quinze olhos enucleados de porcos foram divididos em 3 grupos. O epitélio corneano foi mantido intacto em todos os grupos. Cinco olhos serviram como controle (Grupo 1). No grupo 2, os olhos foram instilados com colírio anestésico de tetracaína, assim como colírio de riboflavina 0,1% (10 mg de riboflavina-5-fosfato em 10 ml de dextran 20% T-500). No grupo 3, solução de riboflavina foi injetada na câmara anterior para permitir a penetração da droga através do endotélio. Os grupos 2 e 3 foram então expostos à radiação UVA (365 nm, 3 mW/cm²) por 30 minutos. Subsequentemente, cortes ultrafinos (8 µm) das córneas foram marcados com anticolágeno tipo I e DAPI (4,6-diamidino-2-fenilindole dihydrocloride) e analisados com microscópio de imunofluorescência. RESULTADOS: As córneas que receberam injeção intracameral de riboflavina e foram irradiadas com UVA (Grupo 3) mostraram um padrão maior de organização das fibras de colágeno em relação aos grupos 1 (Controle) e 2 (instiladas com colírio anestésico e de riboflavina). Macroscopicamente, a coloração amarelada do estroma, que representa a difusão da riboflavina, foi apenas observada nos olhos que receberam riboflavina intracameral. CONCLUSÃO: Foi demonstrado, através de microscopia por imunofluorescência em córneas de porcos, que o epitélio corneano íntegro diminui a efetividade do CXL por reduzir a penetração da riboflavina, e não por impedir a penetração dos raios UVA. Uma concentração intraestromal inadequada de riboflavina limita o efeito do tratamento.Universidade Federal de São Paulo (UNIFESP) Department of OphthalmologyUniversidade Federal de São Paulo (UNIFESP) Department of Biochemistry Molecular Biology DivisionUNIFESP, Department of OphthalmologyUNIFESP, Department of Biochemistry Molecular Biology DivisionSciEL

Heparan sulfate proteoglycans: structure, protein interactions and cell signaling

Heparan sulfate proteoglycans are ubiquitously found at the cell surface and extracellular matrix in all the animal species. This review will focus on the structural characteristics of the heparan sulfate proteoglycans related to protein interactions leading to cell signaling. The heparan sulfate chains due to their vast structural diversity are able to bind and interact with a wide variety of proteins, such as growth factors, chemokines, morphogens, extracellular matrix components, enzymes, among others. There is a specificity directing the interactions of heparan sulfates and target proteins, regarding both the fine structure of the polysaccharide chain as well precise protein motifs. Heparan sulfates play a role in cellular signaling either as receptor or co-receptor for different ligands, and the activation of downstream pathways is related to phosphorylation of different cytosolic proteins either directly or involving cytoskeleton interactions leading to gene regulation. The role of the heparan sulfate proteoglycans in cellular signaling and endocytic uptake pathways is also discussed.Proteoglicanos de heparam sulfato são encontrados tanto superfície celular quanto na matriz extracelular em todas as espécies animais. Esta revisão tem enfoque nas características estruturais dos proteoglicanos de heparam sulfato e nas interações destes proteoglicanos com proteínas que levam à sinalização celular. As cadeias de heparam sulfato, devido a sua variedade estrutural, são capazes de se ligar e interagir com ampla gama de proteínas, como fatores de crescimento, quimiocinas, morfógenos, componentes da matriz extracelular, enzimas, entreoutros. Existe uma especificidade estrutural que direciona as interações dos heparam sulfatos e proteínas alvo. Esta especificidade está relacionada com a estrutura da cadeia do polissacarídeo e os motivos conservados da cadeia polipeptídica das proteínas envolvidas nesta interação. Os heparam sulfatos possuem papel na sinalização celular como receptores ou coreceptores para diferentes ligantes. Esta ligação dispara vias de sinalização celular levam à fosforilação de diversas proteínas citosólicas ou com ou sem interações diretas com o citoesqueleto, culminando na regulação gênica. O papel dos proteoglicanos de heparam sulfato na sinalização celular e vias de captação endocítica também são discutidas nesta revisão.Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP)Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq)Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES)Universidade Federal de São Paulo (UNIFESP) Departamento de BioquímicaUniversidade Federal de São Paulo (UNIFESP) Departamento de OftalmologiaUNIFESP, Depto. de BioquímicaUNIFESP, Depto. de OftalmologiaSciEL

STROMA FORMATION FROM FRESH and CRYOPRESERVED MONONUCLEAR CELLS OBTAINED AT the PRE and POST-MOBILIZATION PHASES for AUTOLOGOUS PERIPHERAL BLOOD STEM CELL TRANSPLANTATION

Univ Texas MD Anderson Canc Ctr, Houston, TX 77030 USAUniversidade Federal de São Paulo, São Paulo, BrazilUniv State São Paulo, São Paulo, BrazilUniversidade Federal de São Paulo, São Paulo, BrazilWeb of Scienc

Quantitative evaluation of experimental choroidal neovascularization by confocal scanning laser ophthalmoscopy: fluorescein angiogram parallels heparan sulfate proteoglycan expression

The objective of the present study was to develop a quantitative method to evaluate laser-induced choroidal neovascularization (CNV) in a rat model using Heidelberg Retina Angiograph 2 (HRA2) imaging. The expression of two heparan sulfate proteoglycans (HSPG) related to inflammation and angiogenesis was also investigated. CNV lesions were induced with argon laser in 21 heterozygous Zucker rats and after three weeks a fluorescein angiogram and autofluorescence exams were performed using HRA2. The area and greatest linear dimension were measured by two observers not aware of the protocol. Bland-Altman plots showed agreement between the observers, suggesting that the technique was reproducible. After fluorescein angiogram, HSPG (perlecan and syndecan-4) were analyzed by real-time RT-PCR and immunohistochemistry. There was a significant increase in the expression of perlecan and syndecan-4 (P < 0.0001) in retinas bearing CNV lesions compared to control retinas. The expression of these two HSPG increased with increasing CNV area. Immunohistochemistry demonstrated that the rat retina damaged with laser shots presented increased expression of perlecan and syndecan-4. Moreover, we observed that the overexpression occurred in the outer layer of the retina, which is related to choroidal damage. It was possible to develop a standardized quantitative method to evaluate CNV in a rat model using HRA2. In addition, we presented data indicating that the expression of HSPG parallels the area of CNV lesion. The understanding of these events offers opportunities for studies of new therapeutic interventions targeting these HSPG.Universidade Federal de São Paulo (UNIFESP) Departamento de OftalmologiaUniversidade Federal de São Paulo (UNIFESP) Departamento de BioquímicaUNIFESP, Depto. de OftalmologiaUNIFESP, Depto. de BioquímicaSciEL

Evaluation of Anti-Nociceptive and Anti-Inflammatory Activities of a Heterofucan from Dictyota menstrualis

Fucan is a term that defines a family of homo-and hetero-polysaccharides containing sulfated L-fucose in its structure. in this work, a heterofucan (F2.0v) from the seaweed, Dictyota menstrualis, was evaluated as an antinociceptive and anti-inflammatory agent. F2.0v (20.0 mg/kg) inhibits 100% of leukocyte migration into the peritoneal cavity after chemical stimulation. However, F2.0v does not alter the expression of interleukin-1 beta (IL-1 beta) and interleukin-6 (IL-6), as well as tumor necrosis factor alpha (TNF-alpha). F2.0v (20.0 mg/kg) has peripheral antinociceptive activity with potency similar to dipyrone. On the other hand, it had no effect on pain response on the hot plate test. Confocal microscopy analysis and flow cytometry showed that F2.0v binds to the surface of leucocytes, which leads us to suggest that the mechanism of action of anti-inflammatory and antinociceptive F2.0v is related to its ability to inhibit the migration of leukocytes to the site of tissue injury. in summary, the data show that F2.0v compound has great potential as an antinociceptive and anti-inflammatory, and future studies will be performed to further characterize the mechanism of action of F2.0v.Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq)Fundacao de Apoio a Pesquisa do Estado do Rio Grande do Norte-FAPERNCoordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES)Ministerio de Ciencia, Tecnologia e Inovacao-MCTIFed Univ Rio Grande Norte UFRN, Dept Biochem, Lab Biotechnol Nat Polymers BIOPOL, BR-59078970 Natal, RN, BrazilFed Univ Rio Grande Norte UFRN, Grad Program Hlth Sci, BR-59078970 Natal, RN, BrazilFed Univ São Paulo UNIFESP, Dept Biochem, BR-04044020 São Paulo, BrazilFed Univ São Paulo UNIFESP, Dept Biochem, BR-04044020 São Paulo, BrazilWeb of Scienc

Interações célula-matriz extracelular em hiperplasias e neoplasias: gival e doenças onco-hematológicas

Os glicosaminoglicanos (GAGs) e os proteoglicanos são componentes da matriz extracelular (MEC) que participam de uma grande variedade de processos biológicos incluindo, crescimento celular, diferenciação e transformação devido à sua capacidade de ligar e modular diversas moléculas envolvidas para o comportamento celular. Neste trabalho as interações célulamatriz extracelular no processo de transformação foram investigadas, usando como modelos de estudo a hiperplasia causada pela fibromatose gengival e as neoplasias hematológicas. Culturas primárias de fibroblastos provenientes de fibromatose gengival hereditária (HGF) e fibroblastos normais tratados com ciclosporina A (NGc) acumulam MEC e super expressam TGF-ß. HGF apresentou mudanças significativas no perfil do glicosaminoglicanos, com aumento relativo do heparam sulfato e absoluto de ácido hialurônico (HA). Foram observadas mudanças importantes na estrutura do condroitim e dermatam sulfato sintetizados por HGF e NGc. A hialuronato sintase (HAS) 1 apresenta a expressão reduzida e HAS 3 está super expressa em HGF e NGc. Um acúmulo de fibronectina (FN) nos fibroblastos HGF e NGc foi encontrada, porém mostraram menor capacidade de adesão. O decorim apresentou menor expressão e padrão nuclear nos fibroblastos derivados de crescimentos gengivais, provavelmente com a perda do controle da retroalimentação negativa à via de sinalização disparada pelo TGF-ß. Uma extrema diminuição da atividade da catepsina B sem diferença na expressão foi encontrada. Um novo tipo de adesão focal foi observado, onde o sindecam 4, vimentina e integrina a5 estão presentes. O efeito seqüencial das passagens resultou na diminuição da biossíntese dos glicosaminoglicanos sulfatados e aumento de ácido hialurônico em todos os fibroblastos analisados. Além da diminuição da síntese, ocorre menor secreção dos GAGs sulfatados para o meio de cultura ao longo das sucessivas passagens. A matriz extracelular e receptores foram investigados antes e após terapia de mobilização com G-CSF em portadores de linfoma, mieloma múltiplo, leucemia assim como doadores sadios. Tanto os bons mobilizadores quanto os maus mobilizadores apresentaram aumento nos níveis séricos de HA e uma diminuição da expressão de CD44 após a terapia de mobilização. O HA sérico também pode ser considerado marcador para infiltração pela neoplasia e fibrose da medula óssea. A quantidade de HA sérico de indivíduos submetidos à terapia com G-CSF indica o sucesso da mobilização. A curva ROC mostrou que o cutoff para falha de mobilização foi de 33,1 ng/mL de HA sérico (sensibilidade 30 por cento e especificidade de 100 por cento). No entanto, os níveis de CD44 não apresentaram co-relação com o sucesso de mobilização. Esses resultados mostram que o HA indica o sucesso de mobilização. Os resultados mostram o envolvimento funcional dos proteoglicanos e glicosaminoglicanos, assim como da FN, catepsina B e citoesqueleto mediando respostas celulares induzidas pela hiperplasia e mobilização de células progenitoras hematopoéticas.#b#fibromatoseBV UNIFESP: Teses e dissertaçõe